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NuPAGE Bis-Tris 和 Bolt Bis-Tris Plus 蛋白预制胶的规格
NuPAGE Bis-Tris 和 Bolt Bis-Tris Plus 蛋白预制胶可提供：
- 出色的蛋白质完整性—中性 pH 有助于降低蛋白质降解
- 分子量分离范围广—选择合适的蛋白预制胶和电泳缓冲液有助于实现蛋白质的最佳分离
- 运行时间短—20 – 35 分钟内分离蛋白
- 有效期长—室温下可保存长达 16 个月
- 高容量孔—WedgeWell 为楔形孔，可使样品上样容量加倍，便于轻松上样 (无需专门的移液器吸头)
| NuPAGE Bis-Tris 预制胶 | Bolt Bis-Tris Plus 预制胶 | |
|---|---|---|
| 选择 | 更高的样品通量，更大的样品容量 | 更快的电泳时间，更大的样品容量 |
| 可选凝胶规格 | 小型：8 cm x 8 cm (1.0 或 1.5 mm 厚) Midi：8 cm x 13 cm (1.0 mm 厚) | Mini：8 cm x 8 cm (1.0 mm 厚) |
| 可选上样孔规格* | WedgeWell 规格 Midi：12+2, 20, 26 孔 WedgeWell 规格 Mini：10, 12, 15, 17 孔 Mini：1, 9, 10, 12, 15, 17, 2D 孔, IPG 孔 Midi：12+2, 20, 26 孔 | WedgeWell 规格 Mini：10 ， 12 ， 15 ， 17 孔 |
| 储存条件 | 4-25°C | |
| 有效期 | 最长 16 个月** | 16 个月 |
| 高批间一致性 | Rf 值(迁移)的变异系数(CV)仅为 2% | Rf 值(迁移)的变异系数(CV)仅为 2% |
| 推荐的上样缓冲液 | NuPAGE LDS 上样缓冲液 | Bolt LDS 上样缓冲液 |
| 推荐的电泳缓冲液 | NuPAGE MES SDS 或 NuPAGE MOPS SDS 电泳缓冲液 | Bolt MES SDS 或 Bolt MOPS SDS 电泳缓冲液 |
| 电泳时间 | 35 分钟（MES 缓冲液） 50 分钟（MOPS 缓冲液） | 20 分钟（MES 缓冲液） 35 分钟（MOPS 缓冲液） |
| 建议的转印缓冲液 | NuPAGE 转印缓冲液 | Bolt 转印缓冲液 |
| 凝胶化学性质 | Bis-Tris 体系 | Bis-Tris Plus |
| 聚丙烯酰胺浓度 | 8%, 10%, 12%, 4–12% | |
| 分离范围 | 15 kDA 至 260kDa (MOPS 缓冲液) 3.5 kDA 至 160kDa (MES 缓冲液) | |
| 适用的电泳槽 | Mini Gel Tank Mini 电泳槽 或 XCell SureLock Mini 电泳槽 | |
| 与中型胶配套的电泳槽 (设备) | SureLock Tandem Midi 凝胶槽， Invitrogen XCell4 SureLock Midi-Cell 或 Bio-Rad Criterion (仅限接头) | 不提供中型胶 |
| 分离模式 | 分子量 | |
| 应用 | SDS-PAGE | |
*并非所有浓度的预制胶都提供每种上样孔规格
** 有效期因凝胶规格而异
Bis-Tris 和 Bis-Tris PLUS 凝胶体系的优势
NuPAGE Bis-Tris 和 Bolt Bis-Tris Plus 预制胶适用于变性凝胶电泳应用。为了获取理想的电泳分离结果，我们推荐使用含有 SDS 的缓冲液。凝胶可以使用 MES SDS 电泳缓冲液来更好地解析较小的蛋白质（1-200 kDa），使用 MOPS SDS 电泳缓冲液来解析中等大小至较大的蛋白质（14-260 kDa）。
Bis-Tris 体系预制胶使用含有以下三种离子的 bis-tris 非连续缓冲液体系：
- 氯离子 (–) 来自凝胶缓冲液，由于其相对于体系中其他阴离子与阳极之间有更强的亲和力，因此可作为前导离子。凝胶缓冲液离子为 bis-tris (+) 和 Cl (–) (pH 6.4)。
- MES 或 MOPS(–) 在电泳缓冲液中充当尾随离子。电泳缓冲液离子有 tris (+)、MOPS/MES (–) 以及十二烷基硫酸盐 (pH 7.3–7.7)。
- Bis-Tris (+) 是凝胶缓冲液和电泳缓冲液中常见的离子。较低 pH 值的凝胶缓冲液 (pH 6.4) 和电泳缓冲液 (pH 7.3–7.7) 的组合可使得电泳过程中的运行 pH 值显著降低至 7
减少蛋白质降解，并形成清晰笔直的条带
NuPAGE Bis-Tris 和 Bolt Bis-Tris Plus 蛋白预制胶的性能经过优化
与传统的 tris-甘氨酸预制胶不同，NuPAGE Bis-Tris 和 Bolt Bis-Tris Plus 预制胶采用 Bis-Tris HCl 缓冲（pH 6.4），工作 pH 约为 7.0。这种中性 pH 值加上独特、温和的样品制备方案，意味着您的蛋白质样品始终处于温和的非酸性条件下，从而保留了蛋白质的完整性并最大程度地减少了蛋白质的修饰(见下一节)。这有助于确保每次都能获得高灵敏度且准确的蛋白质印迹结果。
图1.Bolt Bis-Tris Plus 预制胶的灵敏度更高。使用 iBlot 凝胶转移装置，将 A431 细胞的总细胞提取物从 4-12% 的 Bolt Bis-Tris Plus 预制胶和 4-20% 的 Tris-甘氨酸预制胶上转印到 NC 和 PVDF 膜上。采用 100 ng/mL 人表皮生长因子（hEGF）处理细胞，以上调磷酸 EGF 受体的表达。细胞提取物的蛋白质上样量范围从 20 μg 到 1.2 μg。印迹在 iBind 蛋白免疫印迹处理系统中进行处理，使用 1:200 稀释的磷酸化 EGF 受体 (Tyr1068) (1H12) 小鼠 mAb (Cell Signaling Technology) 和 1:2,000 稀释的抗小鼠 HRP 二抗。
增强样品完整性
样品前处理是成功进行蛋白质分析的关键步骤。在 100°C 加热时，传统 Laemmli 式样品缓冲液的 pH 值从 6.8 变为 5.2。 众所周知，较低的 pH 值可诱导天冬氨酰-脯氨酰（Asp-Pro）肽键裂解，从而导致蛋白质降解。通过维持 >7.0 的 pH 环境，InvitrogenNuPAGE LDS 上样缓冲液 和 Bolt LDS 上样缓冲液能够最大限度地减少这种Asp-Pro裂解，从而保持蛋白质的完整性。如下所示，在整个电泳过程中，使用 Invitrogen NuPAGE 体系可保持样品完整性；用 Laemmli（Tris-甘氨酸）上样缓冲液制备的样品中可见蛋白质降解。Invitrogen NuPAGE 抗氧化剂电泳缓冲液添加剂可在电泳过程中最大程度地减少蛋白质氧化，并保持还原的蛋白质条带清晰锐利。
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图2.出色的样本完整性。与使用 Laemmli（tris-甘氨酸）样品缓冲液（右）制备的样品相比，使用 NuPAGE Bis-Tris 预制胶体系（左）可在整个电泳过程中保持样品的完整性。
锐利笔直的条带
NuPAGE Bis-Tris 和 Bolt Bis-Tris Plus 预制胶的中性 pH 缓冲液可提供清晰笔直的条带。电泳分离过程中，这类预制胶的运行 pH 值接近 7。而在 Laemmli 系统（Tris-甘氨酸）中，凝胶在碱性 pH 值（pH 约 9.5）下运行。在高 pH 值下，残留的未聚合丙烯酰胺可与已分离蛋白质的半胱氨酸和赖氨酸残基发生反应。这可能会影响下游分析，例如蛋白质印迹转印。在 NuPAGE Bis-Tris 和 Bolt Bis-Tris 预制胶的中性 pH 值下，这些反应比在 Tris-甘氨酸预制胶的碱性 pH 值下慢几个数量级，从而能获得更清晰锐利的条带和更高的分辨率。
图3.NuPAGE Bis-Tris 预制胶和传统 tris-甘氨酸预制胶的蛋白质分离效果比较。下面列出的样品在（A）Invitrogen NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液和 NuPAGE 4–12％ Bis-Tris 预制胶或（B）另一制造商的 4–20％ tris- 甘氨酸预制胶中进行电泳。请注意 NuPAGE 蛋白预制胶中样品条带的分辨率更高。在另一制造商的凝胶中则观察到分辨不清的“模糊”条带，这是样品中某些二硫键重新氧化的结果，从而导致迁移率发生轻微变化。泳道 1，6，7，10：Invitrogen Mark12 未染色标准品；泳道 2：高蛋白上样量（4 个蛋白质，6 µg/蛋白）；泳道 3：宽范围标准品；泳道 4，5：大肠杆菌提取物；泳道 8：E-PAGE SeeBlue 预染色标准品；泳道 9：Invitrogen MultiMark 多色蛋白分子量标准。
条带完整性
NuPAGE 和 Bolt 蛋白预制胶可通过中性 pH 凝胶体系来保持蛋白质完整性。这种体系使电泳过程中的蛋白质修饰最小化。
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图4.使用Bolt Bis-Tris Plus 预制胶的蛋白免疫印迹结果干净、清晰，展示出全长蛋白质的蛋白信号，而使用 Bio-Rad TGX 预制胶的蛋白免疫印迹结果则显示有多个低分子量的蛋白降解产物。在 Bolt Bis-Tris Plus 预制胶和 Bio-Rad TGX tris-甘氨酸预制胶上分析了与癌症有关的蛋白激酶（IKKϐ、EPHB、HCK、MAPK、FLT 和 DDR）。将纯化的激酶（每种 10）、MagicMark 蛋白分子量标准和纯化的重组 GST 蛋白上样至 10 孔，4-12％ Bolt 预制胶和 10 孔，4-20％ Bio-Rad TGX 预制胶上。电泳分离样品并按照各制造商的说明书转印到 0.45-μm PVDF 膜上。使用 GST 抗体和 WesternBreeze 化学发光检测试剂进行印迹检测。
条带分辨率
NuPAGE 和 Bolt Bis-Tris Plus 蛋白预制胶相比 Bio-Rad 预制胶可提供更高的分辨率。通过延长 10%的凝胶解析距离，优化的凝胶化学和梯度浓度，您可以在Bolt 预制胶上看到更清晰的蛋白条带分离结果。在下方实验结果中，您可以看到胰岛素 B 链和胰岛素 A 链的两个单独的条带，它们具有相近的分子量。Bolt 预制胶上的蛋白条带看起来更平直，整体条带的信号强度都很均匀，而 Bio-Rad 预制胶的蛋白带则显示较少 (图 5C) 或分辨率较差 (图 5B ，泳道 2 ， 7 和 8)。
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图 5.Bolt Bis-Tris 预制胶条带分辨率—与 Bio-Rad 染色蛋白预制胶的比较。 (A) 使用 Invitrogen SimplyBlue SafeStain 染色的 Bolt Bis-Tris 梯度凝胶。 (B) 用竞争对手的染料染色的 Bio-Rad 的 tris-甘氨酸梯度凝胶。 (C) 两种凝胶第 5 泳道部分的放大图显示胰岛素 B 链 (3.5 kDa) 和胰岛素 A 链 (2.5 kDa)
使用更高通量的 NuPAGE WedgeWell 规格 Bis-Tris 中型凝胶和 SureLock Tandem Midi 凝胶槽，可轻松获得发表级的蛋白电泳数据。两种凝胶均可获得清晰的蛋白条带和笔直的泳道。
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图 6.Bolt Bis-Tris Plus 预制胶的高样品容量。(A) 在 Invitrogen Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 预制胶的 10 孔泳道中，间隔加入体积逐渐增加的荧光蛋白标准品 (40-70μL)。(B) 在 Bio-Rad 的 4-20% 预制胶的 10 孔的泳道中，间隔加入相同的蛋白标准品 (10–40 μL)。可在空白泳道中观察到来自相邻孔中样品的信号，即样品溢出导致的孔间污染。
具有高上样容量孔的 NuPAGE Midi 预制胶
WedgeWell 格式孔为楔形孔，其样品装载容量是传统孔的两倍。WedgeWell Midi 中型蛋白凝胶可在同一次电泳中分离多达 26 份蛋白样品，同时不会影响样品上样量。以下是 WedgeWell Midi 凝胶的主要优势：
- 值得信赖的结果—经过严格测试，有助于确保批次间性能可靠及可重复
- 轻松上样—减少样品溢出和孔间污染
- 上样量更多—轻松地检测稀释样品和低丰度蛋白
- 时间更短—更快地获取所需信息
- 降低成本—单个样品的检测成本，降低每份样品所需的电泳缓冲液用量
- 电泳时间更快—比传统凝胶快 10 分钟
NuPAGE Bis-Tris Midi WedgeWell 格式凝胶符合 Invitrogen 预制凝胶的性能、可靠性和一致性标准。
查看我们的蛋白质凝胶性能保证
推荐的 WedgeWell 楔形孔样品上样体积
| 上样孔大小 | 最大上样体积 (µL) | ||
| WedgeWell 格式中型预制胶 | 标准中型胶 | ||
|---|---|---|---|
| 12 + 2 (小孔) | 100 + 35 | 50 + 15 | |
| 20 | 60 | 30 | |
| 26 | 40 | 20 | |
| WedgeWell 格式小型预制胶 | 标准小型凝胶 | ||
| 10 | 60 | 25 | |
| 12 | 45 | 20 | |
| 15 | 35 | 15 | |
| 17 | 30 | 15 | |
优异的蛋白质分离效果
NuPAGE Bis-Tris Midi WedgeWell 规格凝胶可提供与传统 NuPAGE Bis-Tris Midi 凝胶相同的出色蛋白分离。
图7.适用于 WedgeWell 和标准中型凝胶的条带清晰且分辨率良好的条带。两种胶的上样方式如下：泳道1、120： 5µL PageRuler 宽范围非预染蛋白分子量标准 (编号编号 26630) ；泳道 2-7 ：分别为 10 µg、8 µg、6 µg、4 µg、2 µg、1 µg HeLa 裂解物；泳道 8、13： 5µL Novex 5 非预染蛋白分子量标准 (编号编号 LC5677) ；泳道 9 – 12 ： 含有β-半乳糖苷酶、乳酸脱氢酶和溶菌酶的 240 ng、180 ng、120 ng、60 ng 蛋白混合物；泳道 14-19：分别为 10 µg、8 µg、6 µg、4 µg、2 µg、1 µg 大肠杆菌裂解液。使用 NuPAGE MOPS 电泳缓冲液进行电泳。凝胶使用 SimplyBlue Safe Stain 进行染色
出色的蛋白载量
NuPAGE Bis-Tris Midi WedgeWell 格式凝胶可提高样品负载能力，同时不影响分离性能。
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图8.NuPAGE Bis-Tris WedgeWell 中型凝胶具有出色的蛋白质负载能力。在NUPAGE SDS 样品缓冲液中变性 HEK293 细胞裂解液的总量 (60–0.5 µg)，将其加载到NuPAGE Bis-Tris Wedgewell 4-12% 12+2Well Midi 凝胶中，并在SureLock Tandem Midi 凝胶槽中进行电泳。将等量的 HEK293 细胞裂解物在 XT 样品缓冲液中变性，然后装入 Bio-Rad 4–12% XT12+2 孔中型凝胶中，并在 Criterion Cell Midi 凝胶槽中电泳。
使用 NuPAGE 中型凝胶和 Bio-Rad 进行细胞裂解液电泳和蛋白质免疫印迹分析的比较
按照制造商的说明，将 SureLock Tandem Mid 凝胶槽中 Invitrogen NuPAGE Bis-Tris 预制中型胶的蛋白上样容量与 Bio-Rad Criterion Midi 凝胶槽中 Bio-Rad Criterion Midi 凝胶的蛋白上样容量进行了比较。用RIPA裂解液制备的 HEK 293 细胞裂解液（总蛋白 48-0.5 µg）在各自制造商的样品缓冲液中进行变性，并按照制造商的说明进行电泳。下表列出了在每个泳道中加载的样品，蛋白质质量和 %RIPA 缓冲液。
| 泳道 | +1 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | +1 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 样品 | 上样缓冲液 | iBright 预染蛋白分子量标准 | HEK293 裂解液 | iBright 预染蛋白分子量标准 | 上样缓冲液 | |||||||||
| µg 质量 (µg) | - | - | 48 | 40 | 32 | 24 | 16 | 8 | 4 | 2 | 1 | 0.5 | - | - |
| 上样体积 (µL) | 3 | 3 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 3 | 3 |
| RIPA 裂解液 | - | - | 40 | 33.3 | 26.7 | 20 | 13.3 | 6.7 | 3.3 | 1.7 | 0.8 | 0.4 | - | - |
Invitrogen NuPAGE Bis-Tris 预制胶在较高的裂解液负载下表现优于 Bio-Rad 预制胶，在 Bio-Rad 凝胶上进行的印迹实验显示，在更高的上样量下，所有目标蛋白都会出现条带丢失和模糊。
细胞裂解液的蛋白质印迹和 Western Blot 检测的比较
图 9: 与 Bio-Rad 4–20% TGX 小型凝胶相比，使用NuPAGE 4-12% Bis-Tris 小型凝胶的蛋白质和 RIPA 裂解缓冲液负荷更高，产生的条带更清晰。 将 NuPAGE 4-12％ Bis-Tris 中型凝胶 (12+2 孔) 上样，并逐渐减少 HEK293 裂解物的总蛋白量，在 SureLock Tandem Midi 凝胶槽中进行电泳，然后使用 SureLock Tandem Blot Module 将其转移到 0.45 µm PVDF 膜上；将 Bio-Rad 4-20％ TGX 中型凝胶 (12+2 孔) 在 Criterion Midi Cell 槽中进行电泳，然后使用 Criterion Blotter 将其转移到 0.45 µm PVDF 膜上。使用荧光免疫检测，对两个印迹膜上的三个靶标 (粘蛋白， α - 微管蛋白和 P23) 进行检测。在Bio-Rad印迹上，所有目标在较高负荷下都会出现条带丢失和拖尾现象，而NuPAGE Bis-Tris 凝胶印迹在蛋白质负荷超过 24 µg 时仍能保持卓越的蛋白质加载能力，并呈现出清晰明亮的条带。
对于免疫检测：将膜在 1X Blocker FL 荧光封闭缓冲液中封闭 1 小时。对于荧光：多重检测，使用稀释在封闭溶液中的一抗混合物对膜进行过夜探测：兔抗粘蛋白 (1:15,000)、鼠抗α - 微管蛋白 (1:5,000) 和鼠抗 p23蛋白 (1:5,000)，然后用 1:5,000 稀释的二抗在 1X Blocker FL 中孵育：驴抗兔 Alexa Fluor Plus 680、驴抗鼠 Alexa Fluor 488 和驴抗鼠 Alexa Fluor Plus 800，作用1小时。在 iBright 成像系统上对膜片成像，并对每个印迹进行相同的时间和图像调整设置。
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