最佳方案：流式细胞术活力染色方案

活力染色是任何流式细胞术实验的必需组成部分。死细胞可能因非特异性结合抗体而损害数据的完整性；因此，必需从分析中排除死细胞。 

• 方案 A：用碘化丙啶或 7-氨基-放线菌素 D (7-AAD) 着染死细胞
• 方案 B：用钙黄绿素染料着染活细胞
• 方案 C：用可固定活力染料(FVD) 着染死细胞
  • 12 x 75 mm 管中 C1 标准染色
  • 96 孔板中 C2 染色
  • 在未裂解的全血中用 FVD 进行 C3 染色
  • 在含叠氮化物和/或蛋白质的染色缓冲液中用 FVD 进行 C4 染色
  • 在抗体混合物中用 FVD 进行 C5 染色

碘化丙啶和 7-AAD 可用于着染死细胞，因此可从标准活细胞表面染色方案的分析中排除这些细胞。这些染料不能通过完好的细胞膜，但可以自由进入胞膜受损的细胞。一旦进入死细胞，碘化丙啶就将以化学计量方式嵌插入双链 DNA 或双链 RNA，而 7-AAD 将优先插嵌入双链 DNA。由于这种嵌插由非共价力介导，故这些染料必须仍存在用于重悬细胞以采集数据的缓冲液中，从而死细胞将仍保持被标记。

注释：当需要胞内染色时，碘化丙啶和 7-AAD 都不可用于区分活细胞和死细胞。请参阅下文"用可固定活力染料 (FVD) 着染死细胞，方案 C")，以便用兼容于胞内染色方案的活力染料着染死细胞。

• 活力染料
  • 碘化丙啶染色液（货号 00-6990）
  • 7-AAD 细胞活力染色液（货号 00-6993）
• 流式细胞术染色缓冲液（货号 00-4222）
• 12 x 75 mm 圆底管

1. 着染细胞的表面抗原后，用流式细胞术染色缓冲液洗涤细胞 1-2 次。
2. 将细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色缓冲液中。
3. 每 100 µL 细胞添加 5 µL 碘化丙啶染色液或 7-AAD 染色液。
4. 在冰上或在室温孵育 5-15 分钟。切勿洗涤细胞。
   • 注释：采集期间，碘化丙啶和 7-AAD 必须留在缓冲液中。在添加碘化丙啶或 7-AAD 后，切勿洗涤细胞。
5. 通过流式细胞术分析样本。
   • 注释：应当在初始孵育时间后 4 小时内分析细胞，原因是在碘化丙啶或 7-AAD 长时间存在下造成不利影响细胞的活力。储存在 2–8°C 且避光直至准备好分析为止。

钙黄绿素 AM、钙黄绿素紫色 AM 和钙黄绿素蓝色 AM 标记用染料轻松穿过细胞膜，从而选择性地标记活细胞，以借助流式细胞术或荧光显微镜进行分析；凋亡细胞以及胞膜受损的死细胞不留存钙黄绿素。推荐用膜联蛋白 V 或 7-AAD 共染色，以引起活细胞和死/凋亡细胞之间的分辨率最大。

• 钙黄绿素染料是冻干的并且应在用前复溶于无水 DMSO 中。复溶的染料应在复溶后短时间内使用。为短期储存，请与干燥剂一起储存在 -20°C。避免冻融，并且让小瓶在开封前平衡至室温。
• 可以在用抗体作表面染色之前或之后用钙黄绿素染料染色。建议应染料应由每位研究者滴定，以便在目的测定法中性能最佳。由于钙黄绿素染料不能留存在胞膜受损的细胞中，故这些染料不兼容于胞内染色方案。请参阅下文"用可固定活力染料 (FVD) 着染死细胞，方案 C")，以便用兼容于胞内染色方案的活力染料着染死细胞。

• 钙黄绿素染料
  • 钙黄绿素 AM (超纯级) (货号 65-0853)
  • 钙黄绿素紫色 450 AM (货号 65-0854)
  • 钙黄绿素蓝色 AM (货号 65-0855)
• 无水 DMSO
• [可选] 碘化丙啶染色液 (货号00-6990) 或 7-AAD 活力
• 染色液（货号 00-6993）
• 流式细胞术染色缓冲液（货号：00-4222）
• 12 x 75 mm 圆底管

1. 如对单细胞悬液和/或表面染色所需那样制备细胞。
2. 将 1–5 x 106 个细胞重悬于适量的流式细胞术染色缓冲液 (0.1–1 mL)中。
3. 按所需浓度添加钙黄绿素染料并充分混合。(关于推荐的浓度范围，请参见具体的目标钙黄绿素染料的技术数据表。)
   • 注释：可能需要制作更稀的染料工作溶液，这可以用流式细胞术染色缓冲液或 PBS 进行。
4. 在室温下培养30分钟。避光。
5. 添加 2 mL 流式细胞术染色缓存液并且在室温按 400-600 x g离心5分钟。弃去上清液。
6. 重复步骤 5。
7. [可选] 着染细胞的细胞表面标志物。请参阅我们最佳方案中存在的 "细胞表面标靶染色，方案 A"。
8. 通过流式细胞术分析样本。

可固定活力染料 (FVD) 明亮地着染胞膜受损的细胞并与细胞蛋白质共价交联，不可逆地从所有种类中标记出死细胞。这允许细胞经历超低温保存、固定和透化程序，而死细胞不损失染色强度，确保死细胞可在后续分析中排除；从而改进数据质量。FVD 以一系列颜色可提供，适用配合 UV、紫色、蓝色和红色激光使用。 

使用 FVD 时的最佳做法

• FVD 作为高质量无水 DMSO 中配制的预稀释溶液供应。应使它们避光防潮。与干燥剂一起储存在≤–70°C。可以冻融多达 20 次。
• 让小瓶在开封前平衡至室温为了染色最明亮，最好在不含氮化物且不含蛋白质的 PBS 中用 FVD 进行染色。
• 细胞可以在表面染色前后用 FVD 染色。用 FVD 染色后，细胞也可以超低温保存后稍后时间分析。建议每位研究者为目的测定法确定最佳浓度。
• FVD 可以与固定、透化和胞内染色组合使用。FVD 也可用于使用活的未固定细胞的实验中。
• 为了补偿，建议仅使用经 FVD 染色的目的细胞样品
• 如果死细胞百分比预期低于 5%，则建议取出小量细胞等份试液并将它们在 65°C 加热 1 分钟，随后立即置于冰上 1 分钟。在这种处理后，热杀灭的细胞可与活细胞 1:1 组合并且随后用 FVD 染色。

替代方案 (方案 C3–C5)

• 方案 C3、C4 和 C5 为了易用经历修改，这可能导致死细胞的染色强度降低。如果需要最大染色强度，则应避开这些替代性染色方案。建议每位研究者应确定这些方案修改是否提供足够的死细胞染色强度。
• 可以用 FVD 对未裂解的全血染色。请参阅 "方案 C3 " (下文) 了解详情。
• 可以在不含叠氮化物但含蛋白质的 PBS 中染色。这种方法可能导致死细胞群的染色强度略微降低。参阅 "方案 C4 " (下文)。
• 也可以在含叠氮化物且含蛋白质的 PBS，例如流式细胞术染色缓冲液 (货号004222)中染色。这种方法可能导致死细胞群的染色强度显著降低和/或活细胞群的背景染色增加。参见 "方案 C4" (下文)。
• 可以将 FVD 添加至添加到抗体混合物，之后将该混合物添加至细胞。染色前，FVD 停留在混合物中的时间应尽可能少。最好使用不含叠氮化物、含蛋白质的缓冲液稀释抗体混合物和 FVD。参见 "方案 C5" (下文)。

• Invitrogen™ 可固定活力染料 eFluor ™ 455 (UV) (货号 65-0868) –关闭 UV 激光
• Invitrogen™ 可固定活力染料 eFluor 450（货号65-0863) –关闭紫色激光
• Invitrogen™  可固定活力染料 eFluor 506（货号65-0866) –关闭紫色激光
• Invitrogen™  可固定活力染料 eFluor 520（货号65-0867) –关闭蓝色激光
• Invitrogen™  可固定活力染料 eFluor 660（货号 65-0864) –关闭红色激光
• Invitrogen™  可固定活力染料 eFluor 780（货号 65-0865) –关闭红色激光

• 磷酸盐缓冲液 (PBS)，不含叠氮化物且不含蛋白质
• 流式细胞术染色缓冲液（货号：00-4222）
• 12 x 75 mm 圆底管

1. 在 12 x 75 mm 管中制备细胞
2. 在不含叠氮化物且不含蛋白质的 PBS 中洗涤细胞 2 次。
3. 将细胞按 1-10 x 10106 个细胞/mL 重悬于不含叠氮化物和不含血清/蛋白质的 PBS 中。
   • 注释：为细胞染色一致，不推荐按低于 0.5 mL 染色。
4. 每 1 mL 细胞悬液添加 1 µL FVD，然后立即涡旋混合。
5. 在 2-8°C 孵育 30 分钟；避光。
6. 用流式细胞术染色缓冲液或等同物洗涤细胞 1–2 次。
7. 根据需要继续实验。

• 磷酸盐缓冲液 (PBS)，不含叠氮化物且不含蛋白质
• 流式细胞术染色缓冲液（货号：00-4222）
• 96 孔分析平板

1. 在 96 孔板中根据需要制备细胞。
2. 在不含叠氮化物且不含血清/蛋白质的 PBS 中洗涤细胞 2 次。完全滗析上清液。
3. 通过在不含叠氮化物且不含血清/蛋白质的 PBS 中 1:1,000 稀释，配制 FVD 的工作储备液。制得足够用于 100 μL/孔。作为示例，对于 96 孔，将 10 μL FVD 添加至 10 mL PBS。
4. 向每个控添加 100 μL FVD 工作储备液，然后通过抽吸或温和涡旋混合立即混合。
5. 在 2-8°C 孵育 30 分钟；避光。
6. 用流式细胞术染色缓冲液或等同物洗涤细胞 1–2 次。
7. 根据需要继续实验。

• 磷酸盐缓冲液 (PBS)，不含叠氮化物且不含蛋白质
• 流式细胞术染色缓冲液（货号：00-4222）
• 红细胞裂解缓冲液，如
  • 1X RBC 裂解缓冲液 (货号00-4333)，
  • 10X RBC 裂解缓冲液 (多物种) (货号00-4300)，或
  • 一步法固定/裂解溶液（10X）（货号：00-5333）
• 12 x 75 mm 圆底管

1. 向 12 x 75 mm 管添加未裂解的全血。
2. 每 100 μL 全血添加 1 μL FVD。
3. 添加 FVD 后，添加其他的表面染色抗体。
   注释：或者，可以将 FVD 按每份样品 1 μL 直接添加至表面染色抗体混合物。这种混合物应紧邻添加至全血样品之前制得。
4. 在 2-8°C 孵育 30 分钟，避光。
5. 用流式细胞术染色缓冲液洗涤样品 1–2 次。
6. 裂解红细胞并根据需要继续实验。

• 流式细胞术染色缓冲液（货号：00-4222）
• 12 x 75 mm 圆底管

1. 在 12 x 75 mm 管的流式细胞术染色缓冲液中按 1–10 x 10⁶/mL 制备细胞。
2. 每 1 mL 细胞悬液添加 1 µL FVD，然后立即涡旋混合。
3. 在 2-8°C 孵育 30 分钟；避光。
4. 用流式细胞术染色缓冲液洗涤细胞 1–2 次。
5. 根据需要继续实验。

• 磷酸盐缓冲液 (PBS)，不含叠氮化物且不含蛋白质
• 流式细胞术染色缓冲液（货号：00-4222）
• 12 x 75 mm 圆底管

1. 在 12 x 75 mm 管的 100 μL 缓冲液中按 1–10 x 10 ⁶ 制备细胞 (参见以下备注)。
   注释：为了尽可能提高 FVD 亮度，细胞可以重悬于不含叠氮化物且不含血清/蛋白质 "的 PBS 中(如方案 C1：12 x 75 mm 管中标准染色" [参见上文])。如果最大亮度不重要，细胞可以重悬于流式细胞分析染色缓冲液中 ("方案 C4 ：在叠氮化物和/或含蛋白质的染色缓冲液中使用 FVD 进行染色" [参见上文])。
2. 在流式细胞术染色缓冲液中配制所需的抗体混合物。
3. 紧邻添加至细胞前，将 FVD 按每份待染色样品 0.5-1 μL 添加至抗体混合物。
4. 向细胞样品添加 FVD/抗体混合物。
5. 在 2-8°C 孵育 30 分钟；避光。
6. 用流式细胞术染色缓冲液洗涤细胞 1–2 次。
7. 根据需要继续实验