免疫组织化学技术（IHC）要成功，必须保留组织和细胞的形态，并且抗原位点仍可使用所用检测试剂。

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介绍

固定在免疫组织化学技术中起四个关键作用：

  •  保留并稳定了细胞形态和组织结构
  •  钝化可能降解样品的蛋白水解酶
  •  强化样品 ，使样品能够承受进一步处理和染色
  •  保护样品免受微生物污染以及可能的分解。 

正确的固定方法需要根据应用和待染色的目标抗原进行优化。 这意味着可能必须根据经验确定最佳固定方法。 常用的固定方法包括：

  • 灌注：在放血并用生理盐水灌注后，可以用固定剂灌注组织，以快速固定整个器官。
  • 浸没：将样品浸入固定剂中，然后固定剂扩散至组织或细胞样品中。浸没通常与灌注相结合，以确保整个组织完全固定。
  • 冷冻：含有对化学固定或暴露于用于去石蜡化的有机溶剂过于 不稳定 的抗原的样品可以包埋在  低温保护包埋介质中，如 最佳切割温度（OCT） 化合物，然后快速冷冻并储存在液氮中。
  • 干燥：将用于 ICC 染色 的血液涂片风干，在火焰中挥动，将细胞热固定在载玻片上。

虽然特定的固定剂可以保留某个 抗原 决定簇的免疫反应性，但它可能会破坏其他抗原决定簇，即使这些抗原决定簇位于同一抗原。这里提供的 指南 有助于确定特定系统的适当固定剂，但 重要的是要记住 每种抗原都是唯一的。因此，在选择固定剂时应考虑如下因素：

  • 固定剂类型（甲醛、戊二醛、有机溶剂 等）
  • 渗透率和固定率
  • 固定剂浓度
  • 固定剂 PH
  • 理想的固定温度
  • 固定后处理

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化学与物理固定的比较

化学固定剂交联或沉淀样品蛋白，可掩盖靶标抗原或在长时间固定后阻止抗体接近靶标组织。单个固定剂无法适用于所有组织、样品或抗原。这意味着每一个固定程序都必须经过优化确保能够完成固定且不改变抗原或者干扰组织的内源性位置和细胞细节。

物理固定是制备染色样品的替代方法，具体方法取决于样品来源和靶标抗原的稳定性。例如，血液涂片通常采用干燥法进行固定，从而去除样品中的液体并将细胞固定到载玻片上。对于涉及石蜡去除和抗原回收的严格处理来说过于脆弱的组织首先包埋在防冷冻包埋培养基中，例如 OCT化合物 ，然后快速冷冻并储存在液氮中直至切片。以下提供了福尔马林固定组织中 IHC 染色的示例。

福尔马林固定组织中 IHC 染色

对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE） 的人结肠癌组织切片进行 IHC 染色。为暴露靶蛋白，使用 10 mM pH 6 的柠檬酸钠 缓冲液（例如 00-5000、Ap-9003-125）在 95°C 加热 20 分钟进行热诱导抗原决定簇修复 （HIER）。抗原修复后，将组织冷却至室温并洗涤，在室温下用 PBST 中 3% BSA（产品编号 37525）封闭 30 分钟，然后用 Ezrin 单克隆抗体（产品编号 MA5-13862）以1:100 稀释度在加湿室中标记 1 小时。使用 PBS/0.025% 吐温-20（产品编号 003005）充分洗涤组织并在在室温下用过氧化物酶抑制剂（产品编号 35000）将活性内源性过氧化物酶淬灭 30 min。使用 1:500 稀释的 HRP 偶联山羊抗小鼠 IgG-HRP 二抗（产品编号 31430）进行检测，然后使用金属增强型 DAB 底物试剂盒（产品编号 34065）进行比色分析检测。在光学显微镜上以 40X 放大倍数采集图像。

甲醛、戊二醛和其他化学固定剂

甲醛

使用最广泛的化学固定剂为甲醛，对大多数细胞靶标表现出广泛的特异性。水溶性、无色、有毒和刺鼻气体与蛋白质和核酸上的伯胺反应，形成部分可逆的亚甲基桥交联

甲醛和 多聚甲醛

大多数商业甲醛是由溶解在蒸馏水/去离子水中的多聚甲醛（PFA，聚合甲醛）制备 的，加入高达10%（v/v）的甲醇以稳定甲醛水溶液。稳定对于防止甲醛氧化为甲酸以及再次聚合为多聚甲醛非常重要。为避免使用甲醇稳定的甲醛进行固定，许多方案建议在进行样品固定前立即使用多聚甲醛制备 " 新鲜 " 甲醛。

福尔马林与甲醛

尽管每种固定剂的化学成分不同，但 " 福尔马林 " 和 " 甲醛 " 这两个术语通常可以互换使用。福尔马林采用甲醛制成，但甲醛浓度百分比与真甲醛溶液不同。例如，10% 中性福尔马林缓冲液（NBF 或单纯的福尔马林）真的是一种 4% （v/v）甲醛溶液。这种差异是由于历史上福尔马林是用商用级储备甲醛制备的，其中 含 37%-40% （w/v） 甲醛，方法是在中性 pH 条件下用磷酸盐缓冲液按 1:10进行稀释。

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戊二醛

戊二醛是一种能与氨基和巯基官能团以及可能与芳香环结构反应的二醛化合物。基于戊二醛的固定剂是比甲醛更强的蛋白交联剂。然而，它们渗透组织的速度更缓慢，从而能够提取可溶性抗原并修饰组织结构。由于任何游离、不饱和醛基均会与基于胺基的结构如抗体 （席夫碱形式）共价反应，因此采用基于戊二醛的固定剂固定的组织在进行IHC染色前必须经惰性含胺基分子处理或淬灭。乙醇胺和赖氨酸是最有效的醛类阻滞剂/淬灭剂。

其他 固定剂

基于氯化汞的固定剂有时被用作基于醛的固定剂的替代试剂，以克服细胞保存不佳问题。这些刺激性固定剂通过与胺、酰胺、半胱氨酸等氨基酸以及蛋白质和核酸中的磷酸基团反应而起作用。反应结果为蛋白质和核酸凝固，这可能导致不需要的组织 硬化。使用这些固定剂的益处是能够进行强 IHC 染色同时保存细胞学细节，以便于进行形态学解读。这些固定剂通常包含中性锌盐以保持其张力，它们 可与其他固定剂混合，以提供平衡、刺激性更少的配方。基于氯化汞的固定剂包括 Helly 和 Zenker 固定液。含汞固定剂的一个缺点是，在进行IHC 免疫组化染色之前，必须清除切片中的汞沉淀物。这些基于汞的固定剂的主要缺点是 具有高毒性和腐蚀性，需要特殊的处理步骤。因此原因，这类固定剂不再经常使用。

沉淀固定剂包括乙醇、甲醇和丙酮。这些溶剂能够使大蛋白质分子沉淀并凝固，从而使其变性且有助于细胞学保存。这些试剂也可实现细胞透化，根据样品不同，细胞透化可能至关重要。然而，丙酮尤其可从细胞和组织中提取酯类，从而对细胞形态产生不利影响。尽管如此，丙酮常用作已与载玻片结合的冷冻切片的后固定剂。相比之下，由于溶剂固定剂可导致组织重度收缩，因此不适用于电子显微法 。

使用辛二亚氨酸二甲酯（DMS）（一种胺反应性交联剂）进行的 二酰亚胺酯固定是基于醛的固定方法的一种很少使用的替代方法（Hassel，J. 等人，1974年）。DMS 是 一种同型双官能团试剂 ，可使蛋白质的 α 和 ε-氨基互相交联。二酰亚胺酯 是独一无二的，它能够与 靶标分子上的胺 形成脒键。因此， DMS 不会 改变 蛋白质的净电荷。将 DMS 用作光学和电子显微镜用固定剂的优点包括保留抗原免疫反应性，以及无需封闭醛基。

还有多种在特殊情况下使用的其他免疫组化固定剂。这些固定剂包括与甲醛相似的丙烯醛和乙二醛以及 特别适合在电子显微镜检查之前用作固定剂的四氧化锇。其他特殊固定剂包括碳化二亚胺和其他蛋白质交联剂锌盐溶液、苦味酸、重铬酸钾和乙酸。

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特定应用的固定剂配方

虽然组织化学和组织病理学文本中描述了多种不同的固定剂及其对各种组织组分的影响，但最常见的固定剂及其一般靶抗原如下所示。随后是常用固定剂的配方。

样品类型或抗原

固定剂

大多数低分子量蛋白质、肽和酶

4% （w/v） 多聚甲醛 
4% （w/v） 多聚甲醛-1% （v/v） 戊二醛 
10% 中性 福尔马林缓冲液（NBF）

脆弱组织

Bouin 固定液

小分子，如氨基酸

4% （w/v） 多聚甲醛 -1% （v/v）戊二醛

造血器官（例如 肝脏、脾脏、骨髓）；结缔组织

Zenker 固定液  
Helly 固定液

核酸

Carnoy 固定液

大分子蛋白抗原（ 例如免疫球蛋白）

冰 丙酮 （100%） 或 甲醇（100%）

电子显微法的理想选择4% （w/v） 多聚甲醛-1% （v/v） 戊二醛；1%（w/v）四氧化锇

通常用于特定种类抗原的固定剂

含 4%（w/v）多聚甲醛的 0.1 M 磷酸盐缓冲液
一起混合：
  • NaH2PO4，3.2 g
  • Na2HPO4，10.9 g
  • 蒸馏水，1000 mL
调整 pH 值至 7.4。然后添加：
  • 多聚甲醛，40 g

搅拌条件下加热混合物至 60°C，并加入 1-2 滴 1 N NaOH 以帮助溶解多聚甲醛。冷却并过滤溶液。

含 4% 多聚甲醛-1% 戊二醛的 0.1 M 磷酸盐缓冲液
如上所述制备含 4% 多聚甲醛的 0.1 M 磷酸盐缓冲液。 然后添加：
  • 戊二醛，20 mL
 
Bouin固定液
一起混合：
  • 饱和苦味酸水溶液， 750 mL
  • 40%（w/v）甲醛， 250 mL
  • 冰醋酸，50 mL

室温保存

10% 中性福尔马林缓冲液 
一起混合：
  • 无水 Na2HPO4，6.5 g
  • NaH2PO4• H20，4 g
  • 蒸馏水，900 mL 
调整 pH 值至 7.4，然后添加：
  • 40%（w/v）甲醛， 100 mL

4°C 储存

Zenker固定液
一起混合：
  • 氯化汞，5 g
  • 重铬酸钾，2.5 g
  • 十水硫酸钠，1 g
  • 蒸馏水，100 mL
  • 冰醋酸，5 mL*

混匀以溶解组分。 固定后用蒸馏水洗涤样品 24 小时。切勿使用金属镊子处理组织，因为它们会腐蚀组织。

沉淀溶液
制备：冰丙酮或甲醇（100%）在室温下固定 5-10 分钟。如果需要，非常适合固定和透化处理。
* 在使用前添加组分

常见固定剂配方以及其储存和使用的注释

推荐阅读
  1. Hassel, J. and Hand, A.R. (1974).J. Histochem.Cytochem.22 229-239.
  2. Coons, A.A., et al.(1942) J. Immunol. 45, 159-170
  3. Beisker W et al.(1987) Cytometry 8:235–239.
  4. Cowen T et al.(1985) Histochemistry 82:205–208.
  5. Mosiman VL et al.(1997) Cytometry 30:151–156.
  6. Romijn, Herms J. et al.(1999) J Histochem Cytochem 47:229–236.

仅供科研使用，不可用于诊断目的。