蛋白质印迹法的脱膜和再检测

蛋白质印迹法的剥离和再检测是一种从蛋白质印迹法中去除一次和二次抗体的检测方法，以便对印迹进行再检测。印迹可进行多次剥离和再检测，以显示其他蛋白质或优化蛋白质检测（即抗体浓度），而无需使用多个凝胶和转移。

本页内容

为什么要剥离和重新检测？
重新检测印迹的优点
如何剥离和重新检测蛋白质印迹膜
测试和重新检测剥离的印迹

为什么要剥离和重新检测？

信噪比 (S/N 比) 是指某事物中相关内容 (信号) 与不相关内容 (噪声) 的比率。在蛋白质印迹法中，信号是指被检测的特定蛋白带的密度；噪声是指背景的密度。优化信噪比通常比提高系统的灵敏度更重要。如果无法区分信号和噪声，系统的灵敏度就毫无意义。在需要时，蛋白质印迹法的优化过程非常耗时，而且会耗尽宝贵的样品。重新检测蛋白质印迹法可以节省时间，保护样品，同时可以根据需要进行优化。重新检测蛋白质印迹法可以节省时间，保护样品，同时可以根据需要进行优化。重新检测还可以对同一印迹进行不同目标蛋白的检测。

重新检测印迹的优点

研究人员选择剥离和重新检测蛋白质印迹法的原因主要有几个。以下是最重要的几个：

保存样品	当蛋白质混合物稀有或珍贵时，重复检测可以保存样品，并允许使用相同或不同的抗体分析膜。
节省时间	运行SDS-聚丙烯酰胺凝胶并将蛋白质转移到膜上非常耗时。通过将同一块印迹用于多种不同的检测，可以节省时间。
节省成本	通过重复使用同一块印迹，可以节省凝胶、膜和蛋白质样品的成本。
更轻松地优化检测	高灵敏度化学发光底物的发光强度通常需要优化抗体浓度，以获得最高质量的印迹。通过剥离膜并使用不同抗体浓度重新检测，可以轻松实现优化。
快速确认非典型的结果	当免疫印迹结果不符合预期时，重新检测可以使用相同的蛋白质样本，而无需重新进行凝胶电泳。
纠正错误	免疫印迹法需要经过许多步骤，因此很容易出错。通过剥离膜，印迹可以重复使用。

Example of stripping a western blot membrane with Restore Plus Western Blot stripping buffer to reprobe with different antibodies

蛋白质印迹剥离示例。使用肌动蛋白抗体探测 HeLa 肿瘤细胞裂解物，并用 Thermo Scientific Pierce ECL 蛋白质印迹法底物进行检测。然后用 Thermo Scientific Restore PLUS 蛋白质印迹法剥离缓冲液剥离印迹。然后重新封闭印迹，用环素蛋白 B 抗体重新检测，并用 Pierce ECL 底物检测。

如何剥离和重新检测蛋白质印迹膜

剥离膜的关键是使用导致抗体从抗原中释放出来的条件，但不会导致大量抗原（蛋白质）从膜中释放出来。为了达到这一目的，人们开发出了各种方案，通常包括洗涤剂、还原剂、加热和/或低 pH 值等组合。在剥离过程中，一定量的抗原不可避免地从膜上流失。重要的是，在温和条件下剥离抗体，以尽量减少这种损失。由于每个抗体-抗原对都有其独特的特性，因此没有一种方法可以保证在去除所有抗体的同时保留抗原。

在开始剥离膜以重新检测之前，需要考虑以下事项：

使用 PVDF 膜	PVDF 膜的蛋白质结合能力为 170–200 µg/cm²，由于疏水性更强，因此比其他载体能更好地保留吸附的蛋白质。聚偏氟乙烯（PVDF）比硝化纤维素更不易碎裂，因此在需要多次重复处理（剥离和再探针程序）时更有用。
仅剥离和再探针化学发光和荧光蛋白质印迹法	比色/显色检测试剂会在膜上留下永久可见的污渍，无法通过剥离程序去除。
从温和条件开始	从温和条件开始，以避免样品损失。如果需要分解强抗原抗体对，则使用更严格的条件。
首先检测低丰度蛋白	每轮剥离都会有抗原丢失。通过首先检测低丰度蛋白或低亲和力抗体，可最大程度地减少这些影响。
避免使用抗生物素蛋白偶联物	链霉亲和素与生物素之间的键非常强烈，很难解离以进行重新探测。

蛋白质印迹法膜的温和脱胶

温和脱胶缓冲液配方

甘氨酸	15 g
SDS	1 g
Tween 20	10 mL
去离子水	800 mL
用盐酸将 pH 值调至 2.2
去离子水	至 1000 mL

可替代方案：恢复蛋白质印迹法剥离缓冲液或恢复荧光蛋白质印迹法剥离缓冲液

温和剥离方案（低pH值剥离）

用水冲洗膜，去除膜上多余的化学发光底物。

室温下，将膜蛋白面朝上置于剥离缓冲液中，并轻轻搅拌，孵育 10-20 分钟。确保剥离缓冲液的量足以完全覆盖膜。

优化孵育时间和温度对于获得最佳结果至关重要。对于某些抗体，室温孵育就足够了。然而，高亲和力抗体或饱和印迹（过量的二抗）可能需要在 37°C 下再孵育 5 至 10 分钟。

用洗涤缓冲液（TBST 或 PBST）清洗膜 3 次，每次 5 分钟。

建议：在重新检测前，对膜进行再封闭。

蛋白质印迹法膜的严格剥离

严格剥离缓冲液配方

0.5 M Tris HCl, pH 6.8	12.5 mL
10% SDS	20 mL
2-巯基乙醇	0.8 mL
去离子水	67.5 mL
在使用前在通风橱中加入缓冲液

可替代方案：Restore PLUS 蛋白质印迹法脱色缓冲液

严格的脱色方案（通过加热和洗涤剂进行脱色）

用水冲洗膜，去除膜上多余的化学发光底物。
将膜的蛋白质面朝上放在脱色缓冲液中，在通风橱中轻轻搅拌，在 50°C 下孵育 30 分钟。确保剥离缓冲液的量足以完全覆盖膜。
用洗涤缓冲液（TBST）洗涤膜 6 次，每次 5 分钟。
在重新检测前，对膜进行再封闭。

测试和重新检测剥离的印迹

在剥离后，应对印迹进行测试，以确保所有检测试剂都已去除。膜应进行多次清洗、封闭、与二抗孵育，然后与化学发光底物重新孵育。如果通过剥离程序有效去除了一抗，则二抗不应与膜结合，也不应产生信号。如果印迹上仍然可见条带，则必须加强剥离条件。通常，简单地延长反应时间或提高温度即可完成剥离过程。然而，有时需要改变脱色缓冲液的成分或完全改变方法。

Comparison of chemiluminescent signal after a western blot has been stripped with several different commercially available stripping buffers to see if primary and secondary antibodies were removed before being reprobed.

使用不同商业脱色缓冲液对蛋白质印迹法中一次和二次抗体的去除进行比较。数据为化学发光信号的密度测定分析。

蛋白质印迹法脱色和再检测。硝酸纤维素上脱色缓冲液的比较。通过 SDS-PAGE 分离三种不同浓度的 HeLa 细胞裂解物，并转移到 0.45 μm 硝酸纤维素膜上。(A) 封闭后，使用 SuperSignal West Dura 延长时间底物通过蛋白质印迹法分析膜。用抗 Hsp90 多克隆抗体检测膜，然后用山羊抗兔辣根过氧化物酶结合物进行成像。在初步检测后，根据制造商的说明，将印迹切片分成三部分，分别用Restore 蛋白质印迹剥离缓冲液、Reblot Plus 剥离溶液或 Revitablot 蛋白质印迹剥离缓冲液进行剥离。剥离后，将膜切片清洗、与底物孵育并成像。膜切片重新封闭，并重复上述蛋白质印迹法步骤。（B）密度测定分析表明，Restore 脱色缓冲液能够完全去除信号，并且在初始和重复蛋白质印迹法分析之间保持几乎相同的检测水平。