Western Blotting 转印方法

蛋白质转印是 Western Blot 分析中至关重要的一步，包括将电泳后在凝胶中分离的蛋白质转印至固相支持基质。将蛋白质固定到固相支持基质中有助于使用针对感兴趣蛋白的抗体检测特定蛋白质。典型的固相支持基质有硝酸纤维素、PVDF 或尼龙膜。本文回顾并比较了不同转印方法，阐述了膜的性质以及如何进行选择，并提供了用于 Western Blot 转印的不同缓冲液的配方。

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本页内容

• 转印方法
• 转印条件
• 印迹膜
• 转印缓冲液

Western Blotting 由 Towbin 等人于 1979 年引入，现在用于常规蛋白质分析。Western Blotting 也称为蛋白质印迹或免疫印迹，它使用抗体来识别与转印膜结合的特定蛋白质靶标；抗体-抗原相互作用的特异性使其能够在复杂蛋白质混合物（例如细胞或组织裂解液）中鉴定出靶蛋白。Western Blotting 可用于靶蛋白的定性和半定量分析。

Western Blotting 实验流程的第一步是使用变性凝胶电泳（即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳或 SDS-PAGE）或非变性 PAGE 按分子量分离样本中的蛋白质。电泳结束后，分离的蛋白质被转印或"印迹"到固相支持基质上，通常是硝酸纤维或聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜。在不需要蛋白质分离的流程中，可以使用称为斑点印迹的方法通过点样将样品直接加于膜上。

将蛋白质从凝胶转印到膜上是必不可少的步骤，原因有两个：

1. 凝胶易碎，而膜具有更好的处理能力
2. 像抗体这样的大分子可更好地靶向膜上的蛋白质

转印后，必须封闭膜以防止抗体与膜表面发生非特异性结合。然后依次用抗体和检测探针（例如酶、荧光团、同位素）对转印的蛋白质进行检测。再使用适当的方法检测定位的探针，以记录靶蛋白的位置和相对丰度。

Western Blot 流程中除了面临免疫检测的挑战外，蛋白质从凝胶基质到膜的转印也是一个潜在的难题。蛋白质转印的效率会受到化学成分、凝胶厚度、被转印蛋白质的分子量、所用膜和转印缓冲液的类型以及转印方法的影响。

有多种转印方法，包括扩散转印、毛细管转印、热加速对流转印、真空印迹和电印迹（电转印）。在这些方法中，电转印已成为普遍使用的方法，因为它比其他方法速度更快、效率更高。有三种方法可以将蛋白质从 SDS-PAGE 或非变性凝胶电转印到膜上：

• 湿式电转印（传统湿转或电泳槽转印）
• 半干式电转印（半干式转印）
• 干式电转印（干式转印）

电转印

电印迹或电转印方法依赖于将蛋白质移出凝胶的电泳迁移率。该技术首先将含蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶直接与一片硝酸纤维素膜、PVDF 膜或其他合适的蛋白质结合支持物接触。接下来，将凝胶-膜对“夹”在两个电极之间，这些电极通常浸在导电溶液（转印缓冲液）中。施加电场后，蛋白质脱离凝胶，移动到膜表面，并与膜紧密接触。由此得到的膜便复制了聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质模式。

湿式或电泳槽转印

进行湿式转印时，首先在转印缓冲液中平衡凝胶。然后将凝胶放入“转印三明治”（滤纸-凝胶-膜-滤纸）中，加上衬垫，并用支撑格栅压在一起。将上述支撑好的凝胶三明治垂直放置在不锈钢/铂丝电极之间的槽中，并在槽中充满转印缓冲液。

可以使用标准电场选项，在恒定电流（0.1 至 1 A）或电压（5 至 30 V）下进行多块凝胶的电转印，耗时从 1 小时到整夜。若要转印单块凝胶，可以使用高电场选项，使转印时间缩短至 30 分钟，但需要使用高电压（200 V 以内）或高电流（1.6 A 以内）以及冷却系统来消散产生的巨大热量。

对于 14-116 kDa 之间的蛋白质，转印效率可达 80-100%。转印效率随转印时间的增加而提高，通常，分子量较低的蛋白质转印效率要高于分子量较高的蛋白。但随时间的增加，存在蛋白质膜过度转印（去标记，穿过膜）的风险，尤其当使用较大孔径 (0.45 µm) 的膜处理分子量较低 (<30 kDa) 的蛋白质时。

观看：如何使用 Invitrogen 小型转印模块进行 western 湿式转印
立即查看：湿式电泳槽转印系统

半干式电转印（半干式转印）

在半干式蛋白质转印中，转印三明治水平放置在两个电极板之间。通过增加流过凝胶的电流而不是凝胶周围的电流，可以提高湿式电泳槽上的转印速度。为此，将转印中使用的缓冲液量限制为转印三明治中包含的缓冲液量。在此方法中，至关重要的是将膜片和滤纸切成凝胶大小而无悬垂，并且在转印缓冲液中充分平衡凝胶和滤纸。通常使用超厚滤纸（约 3 mm 厚）来容纳更多的转印缓冲液以进行转印。

甲醇可以包含在转印缓冲液中，但通常会忽略。在恒定电流（0.1 至约 0.4 A）或电压（10 至 25 V）下进行电转印 10 至 60 分钟。快速印迹技术使用不含甲醇的离子强度较高的转印缓冲液和大电流电源，将转印时间减少到 10 分钟以内。在快速方法中，电流保持恒定，电压限制在 25 V 以内。

观看：如何使用 Invitrogen Power Blotter 进行 Western Blot 半干式转印
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干式电转印（干式转印）

干式电印迹方法使用专门的含有创新成分的“转印三明治”，而不使用传统转印缓冲液。使用含缓冲液的独特凝胶基质（转印模组）代替缓冲液或浸湿的滤纸。凝胶基质中的高离子密度有助于实现蛋白质快速转印。在印迹过程中，铜阳极不会因水电解而产生氧气，降低了印迹变形。常规蛋白质转印技术（包括湿式和半干式）使用会产生氧气的惰性电极。通常，通过缩短电极之间的距离、施加高场强和大电流来缩短转印时间。由于无需准备缓冲液，因此与其他转印方法相比，设置和清理时间大大缩短。

观看：如何使用 Invitrogen iBlot 3 干式印迹系统进行 Western Blot 干式转印
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Western Blot 转印方法比较：湿式、半干式和干式转印方法

从凝胶到印迹膜，有效可靠的蛋白质转印是成功进行 Western 检测实验的基础。结果的准确性取决于 Western Blotting 方法的转印效率。传统湿式转印法效率高，但费时费力。与传统湿式转印相比，半干式印迹提供了更多的便利，节省时间，并且可以灵活地使用多种类型的缓冲系统或预组装或自行构建的转印膜组。但是，半干式转印系统转印大分子量蛋白质 (>300 kDa) 的效率较低。干式电印迹无需添加缓冲液，所以既可提供高品质转印，又快速、便捷。

其他转印方法

扩散印迹

扩散印迹依赖于分子的热运动，这使分子从高浓度区域移动到低浓度区域。在印迹方法中，分子的转印取决于蛋白质从凝胶基质中的扩散以及转印膜的吸收。被膜吸收的蛋白质从溶液中"“移除”"，有助于维持驱动蛋白质向膜移动的浓度梯度。扩散印迹法最初是为从（等电聚焦）IEF 凝胶转印蛋白质开发的，也可用于其他大分子，尤其是核酸。用单块凝胶制备多个免疫印迹时，扩散印迹很适合。通过这种方法获得的印迹还可用于通过质谱鉴定蛋白质，以及通过酶谱分析蛋白质。蛋白质回收率通常为可转印蛋白质总量的 25-50%，低于其他转印方法。另外，蛋白质转印无法定量。对于 SDS-PAGE 凝胶中非常大的蛋白质，扩散印迹可能很困难，但是较小的蛋白质通常很容易转印。

真空印迹（真空毛细管印迹）

真空印迹是毛细管印迹的一种变体，来自储液器的缓冲液缓慢通过凝胶和印迹膜抽取到干燥的薄纸或其他吸收性材料中。真空印迹使用平板凝胶干燥器系统或其他合适的凝胶干燥装置，将多肽从凝胶抽取到膜（硝酸纤维素）中。不能使用强力泵，因为高真空会粉碎凝胶或转印膜。凝胶在真空下放置 45 分钟后可能会变干，需要大量的备用缓冲液。凝胶在转印后也容易粘附在膜上，但是进行再水化有助于促进分离。

真空印迹的转印效率在 30% 至 65% 的范围内变化，低分子量蛋白 (14.3 kDa) 转印效率较高，而高分子量蛋白 (200 kDa) 转印效率较低。像扩散印迹一样，真空印迹只能定性转印。

根据所用的转印方法，转印所用的电压和时间会有所不同。以下是使用不同转印方法的条件示例。根据靶蛋白的分子量，可减少（小分子量蛋白质）或增加（高分子量蛋白质）转印时间，以实现更高效的转印。

用于 Western Blotting 的常见转印膜是硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯 (PVDF) 和尼龙膜。这些膜很常用，因为其：

• 表面积/体积比大
• 蛋白结合能力强
• 可延长固定化大分子保留时间
• 易于使用
• 具有针对低背景信号和重现性进行优化的潜力

Western Blot 膜通常以片状或卷状提供，通常厚度为 100 µm，典型孔径为 0.1、0.2 或 0.45 µm。大多数蛋白质可以使用 0.45 µm 孔径的膜成功印迹，而对于低分子量蛋白质或多肽 (<20 kDa)，建议使用 0.1 或 0.2 µm 孔径的膜。

硝酸纤维素膜

硝酸纤维素膜因其高蛋白质结合亲和力，与多种检测方法的兼容性以及固定蛋白质和糖蛋白的能力而成为蛋白质印迹中的常用基质。硝酸纤维素膜也可用于以下应用：Southern 和 Northern 印迹、氨基酸分析和斑点/狭缝印迹。硝酸纤维素膜的蛋白结合能力为 80-100 µg/cm²。人们认为蛋白质固定化是通过疏水相互作用发生的，高盐和低甲醇浓度可改善电泳转移过程中膜对蛋白质的固定，特别是对于分子量较高的蛋白质。硝酸纤维素膜由于不可逆的蛋白质结合效率高，仍然是一种颇受欢迎的选择。

PVDF 膜

PVDF 膜对蛋白质和核酸具有很高的结合亲和力，可用于 Western、Southern、Northern 和斑点印迹等应用。PVDF 膜具有高度疏水性，在浸入转印缓冲液之前必须先用甲醇或乙醇浸湿。在这些应用中，结合可能通过偶极和疏水相互作用发生。PVDF 膜具有 170-200 µg/cm² 的蛋白质结合能力，并且由于具有更大的疏水性，因此比其他载体具有更好的吸附蛋白质保留能力。由于 PVDF 膜的疏水性，这些是疏水蛋白（即膜蛋白）的较优选择。与硝酸纤维素相比，PVDF 脆性和易碎性较小，可用于需要使用新抗体组合对不同靶点进行多轮再处理（去标记和重新标记步骤）的 Western Blotting 实验。

尼龙膜

带电的尼龙（聚酰胺）膜通过离子、静电和疏水相互作用结合蛋白质和核酸。尼龙膜具有高灵敏度，可提供一致的转印结果，并具有 480 µg/cm² 的蛋白质结合能力。尼龙膜的高耐用性在需要去标记和重新标记程序的 Western Blotting 实验中具有优势。使用尼龙膜进行印迹应用的一个明显缺点是可能会与阴离子（例如 SDS）发生非特异性结合以及强结合。

印迹膜的比较

选择膜时，蛋白质的特性（即电荷、疏水性）和下游应用将决定使用哪种膜。要找到适当的膜，可能需要在不同的膜上用特定的蛋白质进行实验。了解每种膜的特性以及优缺点将有助于确定适合您应用的形式。

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用于湿式转印法的几种不同转印缓冲液。所用缓冲液的类型取决于感兴趣蛋白质、凝胶缓冲系统和转印方法。

在大多数实验中，Western 转印缓冲液都忽略了 SDS，因为传递给蛋白质的负电荷会导致它们穿过膜。通常，有足够的 SDS 与来自 SDS-PAGE 分离的蛋白质结合，可以有效地将它们带出凝胶并转至膜支撑上。对于易于沉淀的蛋白质，可能需要添加低浓度 (<0.01%) 的 SDS。应当注意，将 SDS 添加到转印缓冲液中可能需要优化其他转印参数（例如时间、电流），以防止蛋白质通过膜发生过度转印（也称为"穿透"）。

大多数转印缓冲液配方中都包含甲醇，因为甲醇有助于从蛋白质中通过 SDS-PAGE 分离去标记 SDS，从而增加它们与膜的结合能力。但是，甲醇会使下游分析所需的酶失活，并会使凝胶和膜收缩，这可能导致在甲醇中溶解度较差的大分子量蛋白质 (150 kDa) 的转印时间增加。但是，在没有甲醇的情况下，蛋白凝胶可能会在低离子强度的缓冲液中溶胀，因此建议将凝胶预溶胀 30 分钟至 1 小时，以防止条带变形。

用于湿式转印的常用转印缓冲液

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• 手册：蛋白凝胶电泳技术手册
• 手册：Western Blotting 技术手册
• 应用文档：使用 iBlot 2 凝胶转印装置转印高分子量蛋白质