消除蛋白质和抗体样品中的内毒素

高度特异性的亲和树脂能够从各种蛋白质来源、大小和电荷中去除内毒素

作者： Rizwan Farooqui, Ph.D.; Babu Antharavally, Ph.D.; Alice Alegria-Schaffer, M.S. - 07/18/12

传统的内毒素去除方法非常耗时，并且需要对每个正在纯化的靶分子进行显著优化。此外，用于结合内毒素的离子方法需要进行 pH 优化以避免结合高电荷蛋白质，而过滤内毒素的尺寸排阻方法对大蛋白无效。我们开发了一种内毒素去除树脂，可有效去除蛋白和抗体样品中的内毒素。该树脂由环保的天然聚合物纤维素和经 FDA 批准的食品防腐剂聚（ε-赖氨酸）组成。

我们用各种样品类型测试了 Thermo Scientific Pierce 高容量内毒素去除树脂，以证明其具有多功能性。在每项实验中，我们都进行了 1 小时的离心柱法，并测量了所得内毒素水平和蛋白回收率。可从多种样品中有效去除内毒素，同时回收高百分比具有不同分子量和电荷的蛋白。

我们用四种具有不同分子量和电荷的纯化蛋白对内毒素去除树脂进行了测试。我们分别在低内毒素水平和高内毒素水平检测了每种蛋白，以模拟哺乳动物细胞和大肠杆菌培养物中的蛋白样品水平。在所有测试中，内毒素去除 ≥90%（表 1），蛋白回收率 ≥85%（未显示数据）。

表 1.有效去除各种分子量和等电点的蛋白中的内毒素。 

使用 Pierce 高容量内毒素去除离心柱 (0.5mL) 处理样品（1 mL，浓度为 1mg/mL）。

我们还使用复杂生物样品对树脂进行了测试，包括细胞培养上清液、细胞裂解物或血清中的蛋白或抗体。处理后，所有样品的内毒素水平均为 <1 EU/mL(表 2)。

表 2.有效去除各种生物源中的内毒素。 

使用 Pierce 高容量内毒素去除离心柱处理样品 (2mL)，0.5 mL。

我们处理的样品的平均蛋白浓度为 1 mg/mL ，在去除内毒素后，蛋白回收率 ≥85%。为了评估稀释样品中的蛋白回收，我们使用 Pierce 高容量内毒素去除树脂检测了两种浓度的 BSA 和 IgG 样品（0.25 mg/mL 和 10 mg/mL）。我们能够去除 99% 的内毒素；然而，0.1 mg/mL 蛋白样品的蛋白回收率低于典型 85%（表 3）。

表 3.低浓度样品的蛋白回收。 

使用 Pierce 高容量内毒素去除离心柱 (0.5 mL) 处理含 10,000EU  大肠杆菌 菌株 (055:B5) 的 BSA 和人 IgG (2 mL)。

内毒素是源自革兰氏阴性细菌（如 大肠杆菌 ）外膜的脂多糖。由于 大肠杆菌菌株众多，我们测试了 Pierce 高容量内毒素去除树脂去除四种不同 大肠杆菌 菌株内毒素的能力。对于每种菌株，内毒素去除率为> 99%（表 4）。 

表 4.有效去除不同 大肠杆菌 菌株中的内毒素。

使用 Pierce 高容量内毒素去除离心柱 (0.5 mL) 对来自不同 大肠杆菌 菌株的掺有 10,000EU 的 BSA (1 mL, 1 mg/mL) 进行处理。

Pierce 高容量内毒素去除树脂可有效去除蛋白和抗体样品中的内毒素。树脂去除各种蛋白质来源、大小和电荷中的内毒素。即使样品浓度低至 0.25 µg/mL，蛋白回收率也较高 (≥85%)。此外，使用该树脂有效去除四种不同大肠杆菌菌株中的内毒素。高结合能力和低蛋白保留率使该树脂适用于多种蛋白样品类型。

将 Pierce 高容量内毒素去除离心柱 (0.5 mL) 以 500 x g 离心 1 分钟，以去除储存缓冲液。用 0.2 N NaOH (过夜) 洗涤柱，然后用 2M NaCl，再用无内毒素水洗涤。用无内毒素的磷酸盐缓冲盐水平衡树脂三次。在含 10 mM 磷酸盐、0.15M 氯化钠溶液、0.05% 叠氮化钠的缓冲液 (pH 7.2) 中加入样品（1 mL 或 2 mL），并在 22°C 下轻轻混合孵育 1 小时。将柱以 500 x g 的速度离心 1 分钟以收集样品。使用 Thermo Scientific Pierce LAL 显色内毒素定量试剂盒（货号 88282）测量内毒素水平，并使用 Thermo Scientific Pierce BCA 蛋白分析试剂盒（货号 23225）测定蛋白回收率。