分离功能性突触体的方法

保持磷蛋白完整性的同时富集神经元突触蛋白

作者： Hai-Yan Wu 博士；Kay Opperman 博士；Barbara Kaboord 博士 - 2012 年 10 月 5 日

在哺乳动物大脑中，突触功能由蛋白质-蛋白质、蛋白质-脂质和脂质-脂质相互作用共同组成的复合物控制。突触蛋白的相互作用可控制学习、记忆、感官统合、运动协调和情感反应等功能。有证据表明，各种突触蛋白的功能丧失或失调与神经退行性疾病相关。¹ 分离和观察蛋白质组成和突触功能分子变化的能力对于了解这些疾病机制非常重要。

可从神经组织均质化过程中产生的分离神经末端（即突触体）获得突触蛋白的富集片段（图 1）。突触体含完整的突触前末端，包括线粒体和突触泡，具有突触后膜和突触后密集区。因含有功能性离子通道、受体、酶和蛋白以及用于神经递质释放、摄取和储存的完整分子机制，突触体通常用于研究突触功能。由于信号转导经突触神经元蛋白的短暂性磷酸化高度调节，² 因此突触体制备过程中此蛋白修饰的保持至关重要。

在该研究中，我们证明 Thermo Scientific Syn-PER 突触蛋白分离试剂 可有效分离来自神经元组织的含活性突触蛋白的功能性突触体。此外， Syn-PER 试剂通过在组织破坏过程中稳定或保持这些修饰来促进不稳定或短暂性神经元蛋白磷酸化事件的研究。

突触蛋白提取和富集

为确定提取过程的效率，我们比较了使用 Syn-PER 试剂或标准自制缓冲液按照通用 Dounce 提取方案制备的新鲜小鼠脑组织样品中总突触蛋白的产量（图 2）。与使用自制试剂制备的样品相比，使用 Syn-PER 试剂获得的样品中突触蛋白的产量约高出三倍（图 3）。Syn-PER 试剂制备液中回收的总蛋白为 9.7±1.0µg/mg 脑组织。使用自制试剂获得的总蛋白为 3.4±0.8µg/mg 脑组织。

为确定突触体提取程序的特异性，我们进行了免疫印迹分析以检测单个突触蛋白 N-甲基-D-天冬氨酸受体 2B 亚基（NMDAR2B），PSD95，α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-恶唑丙酸（AMPA）受体 GluR2/3/4 和突触小泡蛋白（图 4）。在使用 Syn-PER 试剂制备的样品中，突触体悬浮液中的每个突触蛋白信号均比匀浆中更强；然而，在使用自制试剂制备的样品中，突触体悬浮液中的信号与匀浆中相似，表明该方法几乎无富集作用。通过探测胞质蛋白钙调磷酸酶和 CDK5 以及细胞核标记蛋白 HDAC2 进一步确认突触体悬浮液的纯度。虽然在突触体组分中检测到钙调磷酸酶和 CDK5，但信号与匀浆中相似。相比之下，这些蛋白质的条带在细胞溶质组分中更强。如预期的那样，由于有效地从该组分中去除了细胞核，因此在突触体样品中未检测到 HDAC2。

功能性突触体分离

突触传递依赖于通过突触囊泡胞外分泌刺激神经递质释放，随后通过内吞作用恢复囊泡。为确定使用 Syn-PER 试剂制备的突触体是否具有功能性，通过监测 FM* 2-10 染料（一种亲脂性苯乙烯基荧光染料）的摄取和释放测量突触囊泡内吞作用和胞外分泌。³ FM 2-10 染料在溶液中几乎无荧光，但在突触体中内化时会产生荧光 (Ex506/Em620nm)。当 FM 2-10 染料与使用 Syn-PER 试剂制备的突触体悬浮液一起孵育时，FM 2-10 染料被胞内囊泡内化而使突触体产生荧光。在存在钙的情况下，KCl 刺激可将累积的 FM 2-10 染料释放至溶液中，从而导致 FM 2-10 染料荧光缓慢衰减 18 分钟（图 5）。此结果表明，Syn-PER 试剂制备的突触体悬浮液可实现 FM 2-10 染料的胞内摄取和胞外释放。由于内吞作用和胞外分泌是由多种突触蛋白调节的高度控制生物学过程，因此该检测结果表明突触体悬浮液中的蛋白具有功能。

磷蛋白保留

由于突触传递被蛋白磷酸化高度调控，因此保留突触磷蛋白群体对于了解突触的功能动力学至关重要。我们比较了使用 Syn-PER 试剂制备的样品与其他市售裂解缓冲液的蛋白磷酸化水平。使用特异性识别 AMPA 受体磷酸化 ERK (Thr202/Tyr204)、磷酸化 GluR2 (Try869/Tyr873/Try876) 和磷酸化 PSD95 (Tyr236/Tyr240) 的抗体进行的免疫印迹分析结果显示，使用 Syn-PER 试剂制备的脑组织匀浆和突触体悬浮液中每个磷酸化蛋白的信号明显高于其他市售裂解缓冲液制备的样品（图 6）。总 ERK 信号恒定，表明 ERK 蛋白在两种制备样品中等量。这些数据表明，与其他缓冲液相比，使用 Syn-PER 试剂制备样品时可更好地保留蛋白磷酸化。

Syn-PER 试剂可用于从新鲜神经元组织中制备功能性突触体。Syn-PER 试剂可防止均质化和分离过程中的磷蛋白降解，从而有助于更准确地评估不稳定或短暂性神经元蛋白磷酸化事件。

突触体制备：采用 7 mL 的 Dounce 组织研磨器，使用 10 个上下两冲程在 10 体积的 Syn-PER 试剂或自制试剂⁴ （包括蛋白酶抑制剂；产品编号 87785）中对不含小脑的整个大脑或脑半球 (~200-400mg) 进行均质化。将匀浆以 1200 × g 离心 10 分钟以去除细胞碎片，上层清液以 15000 × g 离心 20 分钟。在相应试剂中，对含有突触体的沉淀物进行温和重悬。

蛋白质印迹：使用 Pierce BCA 蛋白定量试剂盒（产品编号 23225）检测每种样品的蛋白浓度。在变性 2-10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上溶解等量总蛋白（10-20μg/泳道）并将其转印至硝化纤维素膜上。将膜用 3% 牛血清白蛋白封闭并在 4°C 下与一抗孵育过夜。在室温下将印迹用山羊抗兔或山羊抗小鼠辣根过氧化物酶偶联二抗（产品编号 31430）（产品编号 31460）孵育 1 小时，然后洗涤。使用 Thermo Scientific SuperSignal West Pico 化学发光底物（产品编号 34080）对条带进行可视化，然后与膜接触。

FM 2-10 染料摄取和释放检测：600µg 新鲜制备的突触体悬浮液（500mL 含钙 HBSS 中）与 100µM FM 2-10 染料 (Sigma-Aldrich Co.) 在室温下一起孵育。为刺激染料的摄取，将突触体与 30mM KCl 一起孵育。染料内在化 10-15 分钟后，在 15000 × g 下离心 5 分钟使突触体沉淀，再用 HBSS 洗涤两次以去除过量染料。使用或不使用 1.2mM CaCl₂在HBSS 中重悬突触体。该染料由 30 mM KCl 诱导释放，并在 Ex506/Em620nm 处进行监测。

动物饲养管理：C57BL/J6 小鼠（8-12 周龄，雌雄混合）来自 Charles River，居住在罗克福德大学伊利诺大学医学院的动物设施中，被用来获取大脑组织。实验经罗克福德伊利诺大学医学院动物饲养管理和使用委员会批准并按照《美国国立卫生研究院实验动物饲养管理和使用指南》进行。

1. Wishart, T.M., et al.(2006).Synaptic vulnerability in neurodegenerative disease. J Neuropathol Exp Neurol 65:733-9.
2. Salter M.W., et al.(2009).Regulation of NMDA receptors by kinases and phosphatases.Biology of the NMDA receptor. pp.123-48.
3. Baldwin, M.L., et al. (2003).Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem 85:1190-9.
4. Villasana, L.E., et al. (2006).Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus. J Neurosci Methods 158(1):30-6.