蛋白 A/G 磁微珠可实现手动和自动化应用

作者:Thermo Scientific Pierce 蛋白生物学团队 – 2011 年 6 月 1 日

Thermo Scientific Pierce 蛋白 A/G 磁珠可实现高效免疫沉淀 (IP)、免疫共沉淀 (co-IP) 和抗体纯化,并具有高纯度和低背景。这些独特的 1µm 颗粒由聚合物核组成,内有两层磁石,并用封闭剂密封,以减少非特异性结合(表 1;图 1)。磁珠表面与重组蛋白 A/G 偶联,该蛋白结合了蛋白 A 和蛋白 G 的 IgG 结合结构域。与单独使用蛋白 A 或蛋白 G 相比,蛋白 A/G 能够从更多物种和抗体同种型范围中捕获免疫球蛋白。可手动将磁珠与磁力底座或 Thermo Scientific KingFisher 仪等自动平台共同用于工作流程。

表 1.Thermo Scientific Pierce 蛋白 A/G 磁珠的特性

组成封闭的氧化铁颗粒,共价包被单层蛋白 A/G
直径1μm
浓度10mg/mL
结合能力55-85μg 家兔 IgG/mg 磁性颗粒
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图 1Thermo Scientific Pierce 蛋白 A/G 磁珠示意图。

Pierce 蛋白 A/G 磁珠可用于从血清等生物液体中纯化抗体。与其他供应商的蛋白 A 和蛋白 G 磁珠相比,Pierce A/G 磁珠可在更低背景下纯化更多家兔(图 2A)和小鼠(图 2B)血清抗体。此外,Pierce A/G 磁珠对纯化家兔 IgG 的结合容量(每毫克磁珠)是其他供应商磁珠的四倍(图 3)。

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图 2在更低背景的家兔和小鼠血清中分离更多 IgG。通过 96 深孔板的 KingFisher Flex,使用其他供应商的 50 μL Pierce 蛋白 A/G 磁珠以及蛋白 A 和蛋白 G 磁珠从家兔(基因组合 A)和小鼠(基因组合 B)血清(5mg 总蛋白)中纯化 IgG。使用含 0.05% Tween 20 去污剂 (TBST) 的 Tris 缓冲盐溶液洗涤磁珠,使用在 TBST 中稀释的血清孵育 1 小时,洗涤三次,并在室温下使用 0.1M 甘氨酸(pH 值 2.8)洗脱 10 分钟。通过 SDS-PAGE 分离洗脱液并使用 Thermo Scientific Imperial 蛋白质染料(货号:24615)进行染色。通过光密度测定对 IgG 重链带进行定量。对每组重复带进行平均取值,并以 Pierce 蛋白 A/G 磁珠平均值的百分比表示。

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图 3Thermo Scientific Pierce 蛋白 A/G 磁珠的家兔 IgG 结合容量约为主要供应商磁珠的四倍。将来自其他供应商的 Pierce 蛋白 A/G 磁珠以及蛋白 A 和蛋白 G 磁珠加入 96 深孔板中(每孔放置 1mg 磁珠)。使用 KingFisher 96 孔板,使用含 0.05% Tween 20 去垢剂 (PBST) 的磷酸盐缓冲盐溶液洗涤微珠,并使用不同量纯化家兔 IgG (20-200 μg)孵育 1 小时。结合后,使用 PBST 洗涤微珠三次,并在 96°C 下使用 SDS-PAGE 还原样品缓冲液进行洗脱。通过从装载的蛋白质总量中减去流穿液中的蛋白质量,使用 Thermo Scientific Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒(货号:23225)来计算结合量。

Pierce Classic Magnetic IP/Co-IP 试剂盒能从细胞裂解物中高效免疫沉淀靶蛋白(图 4)。该试剂盒还可以有效分离与靶蛋白结合的完整蛋白复合物和 co-IP 蛋白。例如,如果细胞在晚期 G2 期同步,则 Cdk1 的 IP 将免疫共沉淀细胞周期蛋白 B。Pierce 蛋白 A/G 磁珠共免疫沉淀 U2OS 细胞裂解物中的细胞周期蛋白 B,产量等于或高于其他供应商的蛋白 A 和蛋白 G 磁珠(图 5A)。磁珠洗脱液的银染显示所有检测磁珠的背景(不包括抗体)可忽略不计(图 5B)。

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图 4Thermo Scientific Pierce Classic Magnetic IP/Co-IP 试剂盒可有效为 Cdk1 免疫沉淀。U2OS(人骨肉瘤)细胞在血清饥饿的后 G2 期同步,然后在收获前在 20% 胎牛血清中生长 18 小时。在 IP 裂解/洗涤缓冲液中裂解细胞,将 0.75 mg 裂解物(每份样品)分别与和不与抗 Cdk1 抗体在 4°C 下过夜孵育。将三个供应商的 Pierce 蛋白 A/G 磁珠以及蛋白 A 和蛋白 G 磁珠(各 50 μL)入到 96 深孔板中。使用 KingFisher Flex 仪器,用 IP 裂解/洗涤缓冲液洗涤磁珠,与抗体混合物孵育 1 小时,用含 0.5 M NaCl 的 IP 裂解/洗涤缓冲液洗涤两次,用水洗涤一次,并用 SDS-PAGE 还原样品缓冲液在室温下洗脱 10 分钟。通过 SDS-PAGE 分离洗脱液,并通过免疫印迹分析 Cdk1。Pierce 蛋白 A/G 磁珠能够有效进行 Cdk1 的免疫沉淀,产量高于其他供应商的磁珠。

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图 5.Thermo Scientific Pierce Classic Magnetic IP/Co-IP 试剂盒可有效为细胞周期蛋白 B 和 Cdk1 进行免疫沉淀。进行 U2OS 细胞同步并按照图 3 中的说明制备样品。通过 SDS-PAGE 分离洗脱液,并通过蛋白免疫印迹(图 A)分析细胞周期蛋白 B 或银染物(图 B)。Pierce 蛋白 A/G 磁珠能够有效进行细胞周期蛋白 B 的免疫共沉淀,产量高于或等于其他供应商的磁珠。与其他供应商的蛋白 A 和蛋白 G 相比,磁珠结合的抗体相同或更多(图 B)。所有磁珠的非特异性结合均可忽略不计。

Pierce™ Protein A/G Magnetic Beads

Thermo Scientific Pierce 蛋白 A/G 磁珠是一种高性能亲和颗粒,可用于抗体纯化和免疫沉淀反应,兼容手动和自动化磁性分离器。

仅供科研使用,不可用于诊断目的。