人间充质干细胞 Lipofectamine 2000

Lipofectamine 2000 试剂是一种具有专利技术的制剂，可帮助将 Stealth™ RNAi 或短干扰 RNA (siRNA) 高效递送至哺乳动物细胞中从而进行 RNAi 分析。本参考文献提供了使用 Lipofectamine 2000（货号 11668-027）将 Stealth™ RNAi（或 siRNA）转染至人 MSC 间充质干细胞（Cambrex BioScience，货号 PT-2501）的一般指南和优化程序。
 
注：虽然已对转染条件进行了优化，以便将 Stealth™ RNAi 高效递送至 MSC 细胞，但是与感兴趣靶基因相关的其他因素（包括靶基因的转录速率、所得蛋白的稳定性和选择的 Stealth™ RNAi 序列的效率）可能会影响观察到的靶基因敲低程度。设计 RNAi 实验时请考虑这些因素。

转染指南

用 Lipofectamine 2000 将 Stealth™ RNA（或 siRNA）转染至 MSC 细胞时，请遵循以下重要指南：
 

1. 使用与 2 µg/mL Lipofectamine 2000（储备液浓度为 1 mg/mL）形成复合物的 400 nM Stealth™ RNAi（或 siRNA）进行转染。为了提高准确性并降低检测变异性，我们建议针对每个样本条件进行三次平行转染。
2. 在汇合度为 70% 时转染 MSC 细胞。
3. 请勿在转染期间向培养基中添加抗生素，因为这会降低转染效率并导致细胞死亡。
4. 使用 Opti-MEM I 减血清培养基（货号 31985-062）稀释 Lipofectamine 2000 和 Stealth™ RNAi（或 siRNA），然后形成复合物。

开始前请准备好以下试剂：

    * MSC 细胞，在添加 MSCGM SingleQuots（Cambrex BioScience，货号 PT-4105）的间充质干细胞基础培养基（MSCBM；Cambrex BioScience，货号 PT-3238）中培养

注：使用低代数细胞（传代 5 或更低）；确保转染前细胞健康且存活率超过 90%。

    * 感兴趣 Stealth™ RNAi（或 siRNA）（20 µM，溶于退火缓冲液）
    * Lipofectamine 2000 试剂（使用前储存在 +4°C 下）
    * Opti-MEM I 减血清培养基（使用前预热至 37°C）
    * 适当的组织培养板和耗材

通过此程序在 24 孔规格板中使用 Lipofectamine 2000 将 Stealth™ RNAi（或 siRNA）转染至 MSC 细胞。对于其他规格，根据下文推荐试剂用量和体积中的表格确定添加的合适试剂用量。提示：为降低转染多份重复样本（如三份重复样本）时的孔间变异性，按比例扩大试剂体积以形成复合物（第 2 步），然后将等体积的复合物等分至各孔中。
 

1. 转染前一天，在含有 400 µL 不含抗生素的生长培养基的孔中对 3 x 10⁴ 个 MSC 细胞进行铺板。转染时细胞汇合度应达到 70%。
2. 对每份转染样本，按下列步骤制备 Stealth™ RNAi-Lipofectamine 2000 复合物：



• 用 50 µL Opti-MEM I   减血清培养基稀释 200 pmol RNAi Stealth™ RNAi（即，10 µL 的 20 µM Stealth™ RNAi）。轻轻混匀。
• 使用前轻轻混匀 Lipofectamine™ 2000，然后取 1 µL 在 50 µL Opti-MEM I 减血清培养基中稀释。轻轻混匀并在室温下孵育 15 分钟。    
• 孵育 15 分钟后，混合稀释的 Stealth™ RNAi 和稀释的 Lipofectamine 2000（总体积 = 111 µL）。轻轻混匀并在室温下孵育 15 分钟以形成复合物（溶液可能变得浑浊）。



3. 将 111 µL Stealth™ RNAi-Lipofectamine 2000 复合物添加至含有细胞和培养基的各孔中。通过来回摇动平板轻轻混匀。


4. 在加湿 CO₂  培养箱中于 37°C 下孵育细胞 16-24 小时，直至您准备好检测基因敲低效果。

为在不同尺寸的组织培养容器中转染 MSC 细胞，按表中所示根据相对表面积按比例改变 Stealth™ RNAi（或 siRNA）、Lipofectamine 2000、细胞和培养基的用量。注：20 µM Stealth™ RNAi 或 siRNA = 20 pmol/µL。