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Lipofectamine 2000 CD 试剂是一种专有的无动物源性制剂，适用于将核酸转染到真核细胞中。使用 Lipofectamine 2000 CD 转染试剂的优势如下：
- 在许多细胞类型和形式中具有极高的转染效率。
- 无动物源性制剂有助于确保哺乳动物细胞培养和生物生产工艺不含动物源性材料。
- DNA-Lipofectamine 2000 CD 试剂复合物可以直接添加到培养基中的细胞中。
- 无需在转染后去除复合物或更换/添加培养基，但可以在 4-6 小时后去除复合物。
转染重要指南
- 在不含动物源成分的无血清培养基中培养细胞。检测无血清培养基与 Lipofectamine 2000 CD 试剂的相容性，因为一些无血清制剂（例如 CD 293、293 SFM II、CD 杂交瘤）可能会抑制阳离子脂质体介导的转染。
- 要实现一致的无动物源性转染，在络合之前请使用 OptiPro SFM（货号 12309-019）对 DNA 和 Lipofectamine 2000 CD 试剂进行稀释。
- 在高细胞密度下转染细胞：对于贴壁细胞，建议在达到 90-95% 的汇合度时进行转染，以实现高效率、高表达水平，并尽可能减少细胞毒性。对于悬浮培养，在 0.8-1.1×106 个细胞/mL 的密度下转染细胞。可能需要优化。在各实验之间保持相同的接种条件。
- 转染时不要向培养基中添加抗生素，因为这会导致细胞死亡。
- 转染时不要向培养基中加入 Pluronic 试剂或带电荷的培养基提取物（例如硫酸葡聚糖），因为这些试剂可抑制转染
按照以下步骤在24孔板中转染哺乳动物细胞。对于其他规格，请参见“扩大或缩小转染规模”。使用 Lipofectamine 2000 CD 试剂的推荐用量作为起始点，然后根据需要对细胞系和无血清培养基条件进行优化。指定的所有数量和体积均以每个孔为基础。
- 转染前一天，将 0.5-2×105 个细胞铺于无抗生素的 500 μL 生长培养基中，使得转染时的汇合度达到 90-95%。
- 对于每个转染样本，按下列步骤制备复合物：
- 在 50 μL OptiPro SFM 中稀释 DNA。轻轻混匀。
- 使用前轻轻混合 Lipofectamine 2000 CD 试剂，然后取合适量在 50 μL OptiPro SFM 中稀释。在室温下孵育5分钟。注：在30分钟内合并稀释后的 Lipofectamine 2000 CD 试剂和稀释后的 DNA。
- 孵育5分钟后，合并稀释后的 DNA 和稀释后的 Lipofectamine 2000 CD 试剂（总体积=100 μL）。轻轻混匀并在室温下孵育20分钟（溶液可能变浑浊）。注：复合物在室温下可稳定6小时。
- 将 100 μL 复合物添加到含有细胞和培养基的孔中。前后晃动孔板，轻轻混匀。
- 将细胞置于 CO2 培养箱中在 37℃ 下孵育 18-48 小时，然后测试转基因表达。无需更改培养基，但可能需要在 4-6 小时后替换培养基。
- 对于稳定细胞系：在转染后24小时，将细胞以 1:10（或更高稀释度）传代至新鲜生长培养基中。在第二天添加选择性培养基。
要在不同规格的组织培养容器中转染细胞，应根据相对表面积按比例调整 Lipofectamine 2000 CD 试剂、DNA、细胞和培养基的用量，如表格所示。采用自动化高通量系统时，如要在96孔板中进行转染，建议的络合体积为 50 μL。
| 培养容器 | 每孔 表面积 (cm2) | 相对 表面积 vs. 24孔 | 铺板 培养基 体积 | DNA (μg)/ 培养基体积 (μL) | Lipofectamine 2000 CD (μL)/ 培养基体积 (μL) |
|---|---|---|---|---|---|
| 96孔 | 0.3 | 0.2 | 100 μL | 0.2 μg/25 μL | 0.5 μL/25 μL |
| 24孔 | 2 | 1 | 500 μL | 0.8 μg/50 μL | 2.0 μL/50 μL |
| 12孔 | 4 | 2 | 1 mL | 1.6 μg/100 μL | 4.0 μL/100 μL |
| 35 mm | 10 | 5 | 4.0 μg/250 μL | 10 μL/250 μL | |
| 6孔 | 10 | 5 | 2 mL | 4.0 μg/250 μL | 10 μL/250 μL |
| 60 mm | 20 | 10 | 5 mL | 8.0 μg/0.5 mL | 20 μL/0.5 mL |
| 10 cm | 60 | 30 | 15 mL | 24 μg/1.5 mL | 60 μL/1.5 mL |
注：表面积根据组织培养容器的实际测量结果确定，可能因生产商而异。
按照以下步骤在任何规模下转染悬浮细胞。开始前，请确保细胞健康并且细胞活力 >90%。
- 在转染当天，用储备细胞制备单细胞悬液，密度 <3×106 个细胞/mL。以 0.8-1.1×106 个细胞/mL 的密度在不含抗生素的生长培养基中接种细胞。
- 对于每个转染样本，按步骤2所述制备复合物，对每毫升转染细胞采用以下试剂用量和体积：
- 在 34 μL OptiPro SFM 中稀释 0.5-1.5 μg DNA
- 在 34 μL OptiPro SFM 中稀释 1-10 μL Lipofectamine 2000 CD 试剂
- 将复合物添加到含有细胞和培养基的培养瓶中。
- 在测试转基因表达之前，将细胞置于轨道摇床上的 CO2 培养箱中，在 37℃ 下以 125 rpm 的速度振摇培养 24-96 小时。
优化转染
要获得优异的转染效率和较低的非特异性效应，请通过改变细胞密度和 Lipofectamine 2000 CD 试剂浓度来优化转染条件。
质量控制
使用血琼脂板、沙氏葡萄糖琼脂板和液体硫乙醇酸盐培养基检测 Lipofectamine 2000 CD 试剂是否存在微生物污染，并通过转染有报告质粒的 CHO-K1 细胞进行功能分析。
12566014.pps 2004年7月20日