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Lipofectamine LTX® 试剂采用专有的无动物源性配方，用于将 DNA 转染到真核细胞中，且具有低细胞毒性。本参考文件提供了使用 Lipofectamine LTX® 试剂将质粒 DNA 转染到 HT-29 人结肠腺癌细胞（ATCC 货号 HTB-38）中的推荐程序。
转染重要指南
使用 Lipofectamine LTX® 试剂转染 HT-29 细胞时，请遵循以下重要指南：
- 在实验之间保持相同的接种条件。使用低传代细胞；在转染前确保细胞健康且活细胞比例大于 90%。
- 在存在或不存在血清的情况下，均可进行转染。检测无血清培养基与 Lipofectamine LTX® 试剂的相容性。
- 我们推荐在复合前使用 Opti-MEM® I 减血清培养基（货号 31985-070）稀释 DNA 和 Lipofectamine LTX® 试剂。
- 使用 PLUS™ 试剂（货号 11514-015）可增强在 HT-29 细胞中的转染性能
- 请访问 www.lifetechnologies.com/genedelivery 或联系技术服务部门以获取其他专用转染方案。
- Lipofectamine LTX® 试剂适用于基于载体的 RNAi 实验。对于 siRNA 和 Stealth RNAi 转染，我们推荐使用 Lipofectamine RNAiMAX。请访问 www.lifetechnologies.com/RNAi 或联系技术服务部门以获取更多信息。
需要的材料
开始实验前请准备好以下试剂：
- 在补充以下物质的 RPMI 培养基 1640（货号 21870-076）中维持培养的 HT-29 细胞：4 mM L-谷氨酰胺（货号 25030-081）、10% 胎牛血清（货号 16000-044）。在 37oC 下含 5% CO2 的条件下培养细胞。
- 目标质粒 DNA
- Lipofectamine LTX® 试剂（储存在 +4oC 下直至准备使用）和 PLUS™ 试剂（如果需要；储存在 4°C 下）
- Opti-MEM® I 减血清培养基
- 适当的组织培养板和用品
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使用此程序，以24孔规格将质粒 DNA 转染到 HT-29 细胞中（对于其他规格，请参阅下文
扩大或缩小转染）。所有用量和体积均以每孔计。
返回顶部- 转染前一天，使用胰蛋白酶处理细胞并进行细胞计数。每孔含 0.5 ml 完全生长培养基，用 1.5 x 105 个细胞铺板。转染当天，细胞密度应达到 50-80% 融合度。
- （可选）转染当天，从细胞中去除生长培养基，然后更换为 0.5 ml 完全生长培养基。
- 对于每个待转染细胞孔，将 0.75 μg DNA 稀释于 100 μl 不含血清的 Opti-MEM® I 减血清培养基中。
- 如果使用 PLUS™ 试剂：使用前轻轻混合 PLUS™ 试剂，然后将 0.75 μl PLUS™ 试剂（与 DNA 的比例为 1:1）直接加入稀释后的 DNA 中。轻轻混合，然后室温孵育 5-15 分钟。
- 对于每个细胞孔，将 3.75-5.0 μl Lipofectamine LTX® 试剂加入上述稀释后的 Opti-MEM®:DNA 溶液中，轻轻混合，然后室温孵育30分钟，以形成 DNA-Lipofectamine LTX® 试剂复合物。
- 孵育30分钟后，向每个含细胞孔中直接加入 100 μl DNA-Lipofectamine LTX® 试剂复合物，并轻轻前后晃动培养板混合。
- 转染后无需去除复合物。转染后将细胞在 37oC 的 CO2 培养箱中孵育 18-24 小时，然后检测转基因表达。
| 培养容器 | 表面 积/ 孔 | 铺板培养基体积 | 细胞数/孔 | 稀释 培养基 体积 | DNA | Lipofectamine® LTX 试剂 | PLUS™ 试剂 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 96孔 | 0.3 cm2 | 100 μl | 3.0 x 104 | 20 μl | 150 ng | 0.75-1.0 μl | 0.15 μl |
| 48孔 | 1 cm2 | 200 μl | 6.0 x 104 | 40 μl | 300 ng | 1.5-2.0 μl | 0.3 μl |
| 24孔 | 2 cm2 | 500 μl | 1.5 x 105 | 100 μl | 750 ng | 3.75-5 μl | 0.75 μl |
| 12孔 | 4 cm2 | 1 ml | 3.0 x 105 | 200 μl | 1.5 μg | 7.5-10 μl | 1.5 μl |
| 6孔 | 10 cm2 | 2 ml | 7.5 x 105 | 500 μl | 3.75 μg | 18.75-25 μl | 3.75 μl |
25-0990W 2006年11月17日