使用 Lipofectamine LTX 试剂将质粒 DNA 转染到 LNCap 细胞中

Lipofectamine® LTX 试剂是一种专有的无动物源性制剂，其细胞毒性较低，适用于将 DNA 转染到真核细胞中。本参考资料提供了使用 Lipofectamine® LTX 试剂（货号 15338-100）将质粒 DNA 转染到 LNCap 人前列腺上皮癌细胞（ATCC 货号 CRL-1740）中的推荐步骤。

转染重要指南

使用 Lipofectamine® LTX 试剂将 DNA 转染至 LNCap 细胞时，请遵循以下重要指南：

• 转染过程中向培养基中添加抗生素可能导致细胞死亡，尚未对 LNCap 细胞进行该测试。如果您要在转染过程中使用抗生素，请充分测试您的转染条件。
• 在各实验之间保持相同的接种条件。使用低传代细胞；转染前确保细胞健康且细胞活力大于 90%。 
• 转染既可在有血清的条件下进行，也可在无血清的条件下进行。检测无血清培养基与 Lipofectamine® LTX 试剂的相容性。
• 使用 PLUS™ 试剂（货号 11514-015）可增强 LNCap 细胞中的转染性能。
• 我们建议，在络合之前使用 Opti-MEM® I 减血清培养基（货号 31985-062）稀释 DNA 和 Lipofectamine® LTX 试剂。

• 关于其他专业转染方案（包括关于特定细胞类型的 PLUS™ 试剂和抗生素使用建议，以及基于载体的 RNAi 的实验方案），请访问 www.lifetechnologies.com/transfection 或联系技术服务部。
• Lipofectamine® LTX 试剂在基于载体的 RNAi 实验中表现良好。对于 siRNA 和 Stealth™ RNAi 转染，我们建议使用 Lipofectamine™ RNAiMAX（货号 13778-075）。有关更多信息，请访问 www.lifetechnologies.com/RNAi 或联系技术服务部。

需要的材料

开始前请准备好以下试剂：

• 在添加了 10% 胎牛血清（货号 26140-079）和0.1 mM MEM 非必需氨基酸溶液（货号 11140-050）的含 L-谷氨酰胺的 RPMI（货号 11875-085）中维持培养的 LNCap 细胞。在 37℃、5% CO₂ 的条件下培养细胞。
• 感兴趣的质粒 DNA（100 ng/μL 或更高）
• Lipofectamine® LTX 试剂（在 +4℃ 下储存直至使用）和 PLUS™ 试剂（如果需要；在 4℃ 下储存）
• Opti-MEM® I 减血清培养基
• 适当的组织培养板和耗材。

按照以下步骤将质粒 DNA 转染至24孔板中的 LNCap 细胞中（对于其他规格，请参见下文的扩大或缩小转染规模）。指定的所有数量和体积均以每个孔为基础。

1. 转染前一天，用胰蛋白酶处理细胞并进行计数。在含有 0.5 mL 完全生长培养基的每个孔中铺 7×10⁴ 个细胞。转染当天细胞密度应为 50-80% 汇合度。


2. 对于每个孔的待转染细胞，将 0.5 μg DNA 稀释到 100 μL 不含血清的 Opti-MEM® I 减血清培养基中。


3. 如果使用 PLUS™ 试剂：使用前轻轻混匀 PLUS™ 试剂，然后将 0.5 μL PLUS™ 试剂（与 DNA 的比例为 1:1）直接加入稀释后的 DNA 中。轻轻混匀并在室温下孵育 5-15 分钟。


4. 对于每个孔的细胞，将 1.25-2.25 μL Lipofectamine®  LTX 稀释到上述稀释后的 DNA 溶液中，轻轻混匀并在室温下孵育25分钟，以形成 DNA-Lipofectamine® LTX 复合物。


5. 从细胞中吸走生长培养基，替换为 0.5 mL 完全生长培养基。将 100 μL DNA-Lipofectamine® LTX 复合物直接添加到含有细胞的每个孔中，并轻轻来回晃动孔板使其混匀。


6. 转染后不必去除复合物。转染后，将细胞置于 CO₂ 培养箱中在 37°C 下孵育 18-24 小时，然后测定转基因表达。

要在不同规格的组织培养容器中转染 LNCap 细胞，应根据相对表面积按比例调整 Lipofectamine® LTX 试剂、DNA、细胞、培养基和 PLUS™ 试剂的用量，如表格所示（指定的量以每个孔为基础）。

¹ 表面积可能因生产商而异。
² 如果 Lipofectamine® LTX 试剂的体积太小而无法准确分配，并且无法合并稀释液，则在 Opti-MEM® I 减血清培养基中将 Lipofectamine® LTX 试剂预稀释10倍，然后分配10倍的量（应至少为 1.0 μL/孔）。丢弃任何未使用的经稀释 Lipofectamine® LTX 试剂。