使用 Lipofectamine 干细胞转染试剂在 Essential 8 培养基中转染多能干细胞

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PSC 生长培养基、传代试剂以及络合培养基

高效转染的理想起点是在无饲养层培养体系（如 Gibco Essential 8 培养基）于成分明确的底物（如玻连蛋白）上扩增未分化人多能干细胞 (PSC)。在扩增和接种或重新铺板进行转染期间，还建议使用 Gibco Versene 溶液进行传代培养或传代。通过基于 EDTA 的方法温和解离 PSC 培养物，可得到由小细胞团块构成的均一起始细胞集落用于高效转染。

传代

• 按照您选择的培养方式（如由玻连蛋白包被的6孔板、60 cm 培养皿或 T-75 培养瓶）在 Essential 8 培养基或 Gibco Essential 8 Flex 培养基中维持培养 PSC。
  • 在6孔板中增殖 PSC、在24孔板中转染是较为便捷的方式，本方案便采用了这些方式。
• 每 3-5 天在汇合度达到约 85% 前，对 PSC 传代一次。
• 小贴士：在使用 Versene 溶液进行常规 PSC 传代以扩增的过程中，重新铺板包含 5-10 个细胞的大团块能促使细胞在 Essential 8 培养基中重新附着到玻连蛋白上以及存活，而无需添加 Gibco RevitaCell 补充剂。可在 Essential 8 和 Essential 8 Flex 培养基中交替进行 PSC 扩增，从而支持灵活的补料方案。在 Essential 8 培养基中的扩增和转染也可在 Gibco 重组人层粘连蛋白-521 或 Gibco Geltrex 基质上成功进行。

使用玻连蛋白预包被24孔板

1. 取 60 μL 玻连蛋白储备液 (0.5 mg/mL)，加入 6 mL 不含镁或钙离子的 DPBS 中，制备 1:100 玻连蛋白稀释液，得到的工作浓度为 5 μg/mL。
2. 将 200 μL 玻连蛋白稀释液加入每个孔中并在室温下孵育1小时，以 0.5 μg/cm2 玻连蛋白包被24孔板。

• 小贴士：可提前制备玻连蛋白包被的培养板，并在 4℃ 下储存最多1周。细胞铺板前，先在室温下平衡至少1小时。

接种用于转染的细胞

1. 当无饲养层的 PSC 培养物的汇合度低于 85% 时，移除 Essential 8 培养基，每孔使用 2 mL DPBS（无钙离子和镁离子）轻轻洗涤细胞两次。
   重要说明：由于钙离子和镁离子可能干扰 Versene 溶液的作用，因此请使用不含钙离子和镁离子的 DPBS。一次最多处理1至3个孔，以便准确地对解离过程进行计时。
2. 每孔加入 1 mL Versene 溶液并在 37℃ 下孵育 3-5 分钟。
3. 在显微镜下观察培养物，在各细胞收缩并在集落中可见但仍附着于孔内的情况下吸出 Versene 溶液。
4. 在每个孔中加入 1 mL Essential 8 培养基（含 RevitaCell 补充剂），以使 Versene 溶液失活。
   重要说明：与常规传代不同，应将 PSC 培养物解离为包含 3-5 个细胞的小团块，以促进高效转染。如果成簇集落太大（>10 个细胞），只有外缘周围才能有效转染。
5. 用 1 mL 移液器吹下孔内表面附着的细胞，并在板中吹打3次，将细胞解离成包含 3-5 个细胞的小团簇。
6. 在显微镜下确认不存在残留的大团簇。
7. 需要时再吹打3次，并在显微镜下观察。
   重要说明：该方法也可能产生一些单个细胞，加入 RevitaCell 补充剂将促进其存活。
8. 将每个孔的内容物收集到 15 mL 锥形管中。
9. 进行总活细胞计数，包括单个细胞和小团簇内的各个细胞。
   重要说明：正在增殖的 PSC 培养物在转染期间需要空间进行扩增，所以请按推荐的起始细胞数（步骤12）进行铺板以在转染当天达到 30–60% 的汇合度。
10. 使用含有 RevitaCell 补充剂的额外 Essential 8 培养基稀释至最终浓度为100,000个细胞/mL，以将铺板效率差异考虑在内。
11. 从预包被24孔板的各孔中吸出玻连蛋白溶液。
12. 向预包被的24孔板中加入使用 Essential 8 培养基（含 RevitaCell 补充剂）制备的 0.5 mL PSC 悬液，以按50,000个细胞/孔进行铺板。
13. 将平板放回培养箱中，在 37℃、5% CO2 下过夜培养。
    重要说明：仅在转染前1天进行 PSC 铺板，以防止接种的集落生长过大。

在转染当天更换培养基

在第二天，吸出用过的培养基，并在每个孔中加入 0.5 mL Essential 8 培养基（含或不含 RevitaCell 补充剂）。

• 重要说明：在 Essential 8 培养基中转染，而不是在可能抑制 DNA 转染的 Essential 8 Flex 培养基中转染。
• 小贴士：在转染当天无需加入 RevitaCell 补充剂或 rho 激酶抑制剂，但在转染期间加入可以促进 PSC 存活。

DNA 转染方案

在转染当天，请按照以下步骤进行操作，这些步骤已针对在 Essential 8 培养基中使用 Invitrogen Lipofectamine 干细胞转染试剂进行了优化：

转染效率分析

在转染后24小时和48小时，通过荧光显微镜或流式细胞仪观察经 GFP 报告基因质粒转染的 PSC 以进行终点分析（图1）。

图1.iPSC 转染后分析。(A) 荧光图像显示，转染效率为 75%，(B) 明场图像。在 Essential 8 培养基中于玻连蛋白上用 500 ng 的 6 kb EF1α–GFP 质粒和 1 μL Lipofectamine 干细胞试剂转染后44小时，显示出 iPSC。

mRNA 转染方案

在转染当天，请按照以下步骤进行操作，这些步骤已针对在 Essential 8 培养基中使用 Lipofectamine 干细胞试剂进行了优化：

转染效率分析

在转染后24小时和48小时，通过荧光显微镜或流式细胞仪观察经荧光 mRNA 转染的 PSC 以进行终点分析（图2）。

图2.H9 hESC 转染后分析。(A) 荧光图像显示，转染效率为 74%，(B) 明场图像。在 Essential 8 培养基中于玻连蛋白上用 250 ng GFP mRNA 和 1 μL Lipofectamine 干细胞试剂转染后24小时，显示出 H9 hESC。

核糖核蛋白 (RNP) 转染方案

RNP 复合成分：

• Invitrogen GeneArt Platinum Cas9 核酸酶（货号 B25641）
• gRNA（参见“通过体外转录法设计和生成 gRNA”）

在转染当天（将 PSC 铺于24孔板的单孔后1天）执行以下步骤，这些步骤已针对在 Essential 8 培养基中使用 Lipofectamine 干细胞试剂进行了优化：

转染效率分析

在转染后24小时和48小时，使用荧光显微镜或流式细胞仪观察经 GFP 报告基因构建体转染的 PSC，并使用 Invitrogen GeneArt 基因组剪切检测试剂盒或类似检测试剂盒分析双链断裂形成情况（图3）。

图3.H9 hESC 转染后分析。(A) 荧光图像显示，转染效率为 75%，(B) 明场图像。在 Essential 8 培养基中于玻连蛋白上用 500 ng GeneArt Platinum Cas9 核酸酶、125 ng gRNA、50 ng GFP mRNA 和 1 μL Lipofectamine 干细胞试剂转染后24小时，显示出 H9 hESC。(C) 转染后48小时，NCRM1 细胞、Gibco iPSC 和 H9 hESC 的基因组剪切检测分析显示，HPRT 基因座内形成 20–39% 的 indel。

通过体外转录法设计和生成 gRNA

除 RNP 转染效率外，在给定基因座处 DSB/indel 形成的效率也可能取决于 gRNA 设计。使用 Invitrogen GeneArt CRISPR 检索和设计工具（获取链接：thermofisher.com/crisprdesign）来检索我们数据库中针对人类基因组中每个基因的 >600,000 条预设计 gRNA 序列。这些预设计的 gRNA 针对基因敲除进行了优化，且通常以每个基因的前三个转录外显子为靶标。

使用 Invitrogen GeneArt Precision gRNA 合成试剂盒（货号 A29377）克隆并生成您自己的 gRNA。可采用 Invitrogen Qubit 3 荧光计（货号：Q33216）联合 Invitrogen Qubit RNA BR 检测试剂盒（货号：Q10210）定量测定 gRNA 浓度。