使用 Lipofectamine 干细胞转染试剂在 StemFlex 培养基中转染多能干细胞

PSC 生长培养基、传代试剂以及络合培养基

成分	货号
StemFlex 培养基	A3349401
Geltrex 经 hESC 验证的无 LDEV 低生长因子基底膜基质	A1413302
重组人层粘连蛋白-521	A29248
不含钙、镁离子的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS)	14190144
Versene 溶液	15040066
TrypLE Select 酶 (1X)，无酚红	12604013
RevitaCell 补充剂	A2644501
Opti-MEM I 减血清培养基	31985062

高效转染的理想起点是在无饲养层培养体系（如 Gibco StemFlex 培养基）中于 Gibco Geltrex 基质或成分明确的底物（如重组人层粘连蛋白-521）上扩增未分化人多能干细胞 (PSC)。

传代

按照您选择的培养方式（如由 Geltrex 基质或重组人层粘连蛋白-521 包被的6孔板、60 cm 培养皿或 T-75 培养瓶）在 StemFlex 培养基中维持培养 PSC。在6孔板中增殖 PSC、在24孔板中转染是较为便捷的方式，本方案便采用了这些方式。
每 3-5 天在汇合度达到约 85% 前，对 PSC 传代一次。
小贴士：在使用 Gibco Versene 溶液进行常规 PSC 传代以扩增的过程中，重新铺板包含 5-10 个细胞的大团块促使细胞在 StemFlex 培养基中重新附着到玻连蛋白上以及存活，而无需添加 Gibco RevitaCell 补充剂。PSC 可在 StemFlex 培养基中扩增，以便后续在 Geltrex 基质或重组人层粘连蛋白-521 上进行转染。

使用 Geltrex 基质或重组人层粘连蛋白-521 预包被24孔板

Geltrex 基质包被

取 Geltrex 基质，加入含有 GlutaMAX 补充剂的冷 Gibco DMEM/F-12 培养基（货号 10565）中，制备 Geltrex 基质的 1:100 稀释液。
使用前，向24孔板的每个孔中加入 300 μL 稀释的 Geltrex 基质，并在 37℃ 下孵育 ≥1 小时。

重组人层粘连蛋白-521 包被

取 300 μL 重组人层粘连蛋白-521 储备液 (0.5 mg/mL)，加入 12 mL DPBS 中，制备重组人层粘连蛋白-521 的 1:40 稀释液，最终浓度为 2.5 μg/mL。
向24孔板的每个孔中加入 400 μL 重组人层粘连蛋白-521 稀释液，在 37℃ 下孵育 ≥2 小时，以 0.5 μg/cm² 重组人层粘连蛋白-521 包被各孔。

重要说明：重组人层粘连蛋白-521 的最佳包被浓度取决于 PSC 细胞系，范围为 0.5-2 μg/cm²。如果您观察到有细胞未完全附着的区域，则提高浓度。
小贴士：可提前制备用 Geltrex 基质或重组人层粘连蛋白-521 包被的培养板并在 4℃ 储存最多2周。细胞铺板前，先在室温下平衡至少1小时。

接种用于转染的细胞

为最大限度提高转染效率，建议接种使用 Gibco TrypLE Select 酶制备的 PSC 单细胞悬液。
重要说明：由于解离成单细胞的 PSC 的铺板效率低于成群细胞的传代效率，我们建议添加 RevitaCell 补充剂，用于在 StemFlex 培养基中重新铺板于 Geltrex 基质或重组人层粘连蛋白-521 上进行过夜培养，以便第二天转染。
当无饲养层的 PSC 培养物的汇合度低于 85% 时，移除 StemFlex 培养基，在6孔板中每孔使用 2 mL DPBS 轻轻洗涤细胞两次。
向每个孔中加入 1 mL TrypLE Select 酶，涡旋以均匀包被 PSC，在 37℃ 下孵育 3-5 分钟。
使用 1 mL 移液器轻轻吹打细胞悬液 5-10 次，将细胞悬液解离成单个细胞。
将细胞悬液转移至含有 3 mL StemFlex 培养基的 15 mL 锥形管中，以使 TrypLE Select 酶失活。
以 200 x g 离心细胞悬液4分钟。
吸出上清液，将细胞沉淀重悬于 3 mL 含 RevitaCell 补充剂的 StemFlex 培养基中，制成单细胞悬液。
使用 Invitrogen Countess II 自动细胞计数仪或其他方法进行总活细胞计数。
使用含有 RevitaCell 补充剂的额外 StemFlex 培养基稀释至最终浓度为100,000个细胞/mL。
从预包被24孔板的各孔中吸出 Geltrex 基质或重组人层粘连蛋白-521。
重要说明：正在增殖的 PSC 培养物在转染期间需要空间进行扩增，所以请按推荐的起始细胞数（步骤11）进行铺板以在转染当天达到 30% 的汇合度。
向预包被的24孔板中加入使用含 RevitaCell 补充剂的 StemFlex 培养基制备的 0.5 mL PSC 悬液，以按50,000个细胞/孔进行铺板。
将平板放回培养箱中，在 37℃、5% CO₂ 条件下过夜培养细胞。

在转染当天更换培养基

制备含有 RevitaCell 补充剂的 Gibco Opti-MEM I 培养基溶液。临转染前，吸出 StemFlex 培养基并向每个孔中加入 0.5 mL 添加补充剂的 Opti-MEM I 培养基。

重要说明：在含有 RevitaCell 补充剂的 Opti-MEM I 培养基中转染，而不是在可能抑制转染的 StemFlex 培养基中转染。

DNA 转染方案

请按照以下步骤进行操作，这些步骤已针对在 StemFlex 培养基中使用 Invitrogen Lipofectamine 干细胞转染试剂进行了优化：

步骤	管	复合成分	用量/孔（24孔板）
1	管1	Opti-MEM I 培养基	25 μL
1	管1	Lipofectamine 干细胞试剂	2 μL
2	管2	Opti-MEM I 培养基	25 μL
2	管2	DNA (0.5–5 μg/μL)	500 ng
3	将管2溶液加入管1中，混匀。
4	将步骤3所得混合物在室温下孵育10分钟。
5	临转染前，吸出 StemFlex 培养基并向每个孔中加入 0.5 mL 含 RevitaCell 补充剂的 Opti-MEM I 培养基。
6	向每孔加入 50 μL 步骤4所得复合物；轻轻涡旋平板，确保复合物均匀分布至整个孔中。
7	将培养皿放回培养箱中，在 37℃、5% CO₂ 下培养细胞4小时。重要说明：转染4小时后，向每个孔中加入加热至室温的 0.5 mL StemFlex 培养基，将平板放回培养箱中，在 37℃、5% CO₂ 下过夜培养细胞。
8	如果要对 PSC 进行48小时转染，则在第二天吸出 StemFlex 培养基和转染复合物，每孔加入 0.5 mL 新鲜 StemFlex 培养基；在汇合度达到 85% 前传代。

转染效率分析

在转染后24小时和48小时，通过荧光显微镜或流式细胞仪观察经 GFP 报告基因构建体转染的 PSC 以进行终点分析（图1）。

图1.iPSC 转染后分析。(A) 荧光图像显示，转染效率为 71%，(B) 明场图像。在 StemFlex 培养基中于 Geltrex 基质上用 500 ng 的 11.2 kb EF1α-GFP 质粒和 2 μL Lipofectamine 干细胞试剂转染后44小时，显示出 iPSC。

小贴士和技巧

实现最佳转染所需的 Lipofectamine 干细胞试剂用量取决于铺板的 PSC 量以及所用的 DNA 量。
对于转染效率评估，关键的一点是所用的质粒需含有在人 PSC 中具有活性的启动子（如 EF1α 启动子）；一些启动子（如巨细胞病毒 [CMV] 启动子）可导致 PSC 转录沉默。
如果 DNA 制备物具有明显的细胞毒性，则将 DNA 量减少至 250 ng/孔，可在维持高效转染的同时提高细胞活率。

mRNA 转染方案

请按照以下步骤进行操作，这些步骤已针对在 StemFlex 培养基中使用 Lipofectamine 干细胞转染试剂进行了优化：

步骤	管	复合成分	用量/孔（24孔板）
1	管1	Opti-MEM I 培养基	25 μL
1	管1	Lipofectamine 干细胞试剂	2 μL
2	管2	Opti-MEM I 培养基	25 μL
2	管2	mRNA (0.5–5 μg/μL)	250-500 ng
3	将步骤3所得混合物在室温下孵育10分钟。
4	临转染前，吸出 StemFlex 培养基并向每个孔中加入 0.5 mL 含 RevitaCell 补充剂的 Opti-MEM I 培养基。
5	向每孔加入 50 μL 步骤4所得复合物；轻轻涡旋平板，确保复合物均匀分布至整个孔中。
6	向每孔加入 50 μL 步骤4所得复合物；轻轻涡旋平板，确保复合物均匀分布至整个孔中。
7	将培养皿放回培养箱中，在 37℃、5% CO₂ 下培养细胞4小时。重要说明：转染4小时后，向每个孔中加入加热至室温的 0.5 mL StemFlex 培养基，将平板放回培养箱中，在 37℃、5% CO₂ 下过夜培养细胞。
8	如果要对 PSC 进行48小时转染，则在第二天吸出 StemFlex 培养基和转染复合物，每孔加入 0.5 mL 新鲜 StemFlex 培养基；在汇合度达到 85% 前传代。

转染效率分析

在转染后24小时和48小时，通过荧光显微镜或流式细胞仪观察经荧光 mRNA 转染的 PSC 以进行终点分析（图2）。

图2.iPSC 转染后分析。(A) 荧光图像显示，转染效率为 68%，(B) 明场图像。在 StemFlex 培养基中于 Geltrex 基质上用 250 ng GFP mRNA 和 2 μL Lipofectamine 干细胞试剂转染后44小时，显示出 iPSC (NCRM1)。

小贴士和技巧

生成特定生物读数所需的 mRNA 量因用户的应用而异；Lipofectamine 干细胞试剂可在一系列用量范围内将 mRNA 高效地递送到 PSC 中。
除目标转录本之外，纳入的独立 GFP mRNA (50 ng)，可独立评估转染效率。
如果 mRNA 制备物具有明显的细胞毒性，则将 mRNA 量减少至 250 ng/孔，可在维持高效转染的同时提高细胞活率。
体外转录 (IVT) mRNA 的生成和纯化方法可导致毒性以及翻译阻遏。
- 用于体外转录的 Invitrogen mMESSAGE mMACHINE 试剂盒中包含的抗反向帽类似物 (ARCA) 系统和 Invitrogen MEGAclear 柱可用于去除未加帽的转录本和能导致细胞毒性的小型未掺入核苷酸。

核糖核蛋白 (RNP) 转染方案

RNP 复合成分：

Invitrogen GeneArt Platinum Cas9 核酸酶（货号 B25641）
gRNA（参见“通过体外转录法设计和生成 gRNA”）

在转染当天（将 PSC 铺于24孔板的单孔后1天）执行以下步骤，这些步骤已针对在 StemFlex 培养基中使用 Lipofectamine 干细胞试剂进行了优化：

步骤	管	复合成分	用量/孔（24孔板）
1	管1	Opti-MEM I 培养基	25 μL
1	管1	Lipofectamine 干细胞试剂	2 μL
2	管2	Opti-MEM I 培养基	25 μL
		Cas9 核酸酶	1.5 μL
		gRNA (0.1–0.5 μg/μL)	375 ng
3	将管2溶液加入管1中，混匀。
4	将步骤3所得混合物在室温下孵育10分钟。
5	临转染前，吸出 StemFlex 培养基并向每个孔中加入 0.5 mL 含 RevitaCell 补充剂的 Opti-MEM I 培养基。
6	向每孔加入 50 μL 步骤4所得复合物；轻轻涡旋平板，确保复合物均匀分布至整个孔中。
7	将培养皿放回培养箱中，在 37℃、5% CO₂ 下培养细胞4小时。重要说明：转染4小时后，向每个孔中加入加热至室温的 0.5 mL StemFlex 培养基，将平板放回培养箱中，在 37℃、5% CO₂ 下过夜培养细胞。
8	如果要对 PSC 进行48小时转染，则在第二天吸出 StemFlex 培养基和转染复合物，每孔加入 0.5 mL 新鲜 StemFlex 培养基；在汇合度达到 85% 前传代。

转染效率分析

在转染后24小时和48小时，使用荧光显微镜或流式细胞仪观察经 GFP 报告基因构建体转染的 PSC，并使用 Invitrogen GeneArt 基因组剪切检测试剂盒或类似检测试剂盒分析双链断裂 (DSB) 形成情况（图3）。

图3.iPSC 转染后分析。(A) 荧光图像显示，转染效率为 60%，(B) 明场图像。在 StemFlex 培养基中于 Geltrex 基质上用 1.5 μg GeneArt Platinum Cas9 核酸酶、375 ng gRNA、50 ng GFP mRNA 和 2 μL Lipofectamine 干细胞试剂转染后24小时，显示出 iPSC (NCRM1)。(C) 转染后48小时，NCRM1 iPSC 和 H9 hESC 的基因组剪切检测分析显示，HPRT 基因座内分别形成 35% 和 37% 的 indel。

小贴士和技巧

在转染复合物中加入 50 ng 的 GFP mRNA 以及 RNP 复合物可以提供转染效率的独立测量指标。
在 Opti-MEM I 培养基中于玻连蛋白上重新铺板期间，也可反向转染 PSC，但接种的细胞数量应上调至150,000个细胞/孔。解离 PSC，然后按上述推荐方法制备转染复合物。吸出包被液，将细胞悬液加入孔中，覆盖转染复合物并涡旋混匀。当 PSC 沉降并附着时，开始发生转染。

通过体外转录法设计和生成 gRNA

除 RNP 转染效率外，在给定基因座处 DSB/indel 形成的效率也可能取决于 gRNA 设计。使用 Invitrogen GeneArt CRISPR 检索和设计工具（获取链接：thermofisher.com/crisprdesign）来检索我们数据库中针对人类基因组中每个基因的 >600,000 条预设计 gRNA 序列。这些预设计的 gRNA 针对基因敲除进行了优化，且通常以每个基因的前三个转录外显子为靶标。

使用 Invitrogen GeneArt Precision gRNA 合成试剂盒（货号 A29377）克隆并生成您自己的 gRNA。可采用 Invitrogen Qubit 3 荧光计（货号：Q33216）联合 Invitrogen Qubit RNA BR 检测试剂盒（货号：Q10210）定量测定 gRNA 浓度。

下载 PDF 版本

仅供科研使用，不可用于诊断目的。