神经科学支持 - 疑难解答

与许多其它细胞相比，神经元转导更为困难。提高转导效率的主要方法是采用更多数量的病毒颗粒标记细胞。对于原代神经元，在铺盘时转导要比已培养细胞转导效果更好。此外，蛋白的表达在神经元中发生较慢，表达高峰通常发生于2-3天后而非转导后16小时。

DiI是一种亲脂性染料，多数保留在细胞脂质内。当细胞经去垢剂通透或是用乙醇固定时，会去除掉脂质和染料。如果需要通透，可以使用CM-DiI标记，因为CM-DiI会共价结合膜里面的蛋白；部分信号会随着固定/通透丢失，但残留的信号仍足以被检测出。

由于这些染料插入脂质膜，任何对膜的破坏都将导致染料流失。这包括用Triton™ X-100之类的去垢剂或是甲醇之类的有机溶剂通透。通透是胞内抗体标记所必需的，但它会导致染料流失。相反，CFDA SE之类活性染料能够共价连接到细胞组分，因此可以在固定和通透之后更好的保留。

FluoroMyelin™是脂质染料，任何脂质都可以被其染色。髓鞘中脂质含量更高，因而其染色程度要比其他膜成分更强烈。

观察到这两种类型的运输是生物胞素的典型特征。带有标记的霍乱毒素B类的产品只进行逆向运输。

以下是我们的建议：

• 使用我们偶联了明亮的、光稳定性Alexa Fluor™ 染料的二抗。每个荧光二抗IgG分子上标记有2-8个荧光基团，每个一抗含有三个潜在的二抗结合位点，能够提供大约10-20荧光团/抗体的信号放大等级。
• 此外，也可采用生物素结合的二抗以及荧光素-链霉亲和素偶联物检测一抗，或者采用链霉亲和素桥连Qdot™ 生物素等生物素结合的报告载体来检测一抗。尽管额外的孵育和内源性生物素封闭步骤会增加处理时间，但链霉亲和素标记也会提高检测灵敏度。
• 对于低丰度的靶标，为得到最佳信噪比，可能要对信号进行放大。酪胺信号放大技术（TSA）是一种酶介导的检测方法，其利用辣根过氧化物酶（HRP）的催化活性产生具备反应活性的荧光团标记酪胺自由基。这些短寿命的酪胺自由基共价结合到相互作用位点临近的残基上，在HRP-靶相互作用位点上产生放大的荧光信号。
• 如需提升快速漂白染料的检测灵敏度，我们的SlowFade™ Diamond或ProLong™ Diamond 抗猝灭试剂已经证实可增加光稳定性，降低固定细胞、组织和无细胞制备物中的初始荧光淬灭。
• 请访问此网页了解进一步的优化的要点。

• 需要进行封闭操作以减少由非特异性抗体结合产生的背景荧光。常用的封闭步骤是加入2-5％牛血清白蛋白（fraction V defatted BSA）溶液。另一种方法是采用5-10％二抗种属来源的血清溶液。例如，使用山羊抗小鼠IgG二抗时，样品可以被5-10％正常山羊血清有效封闭。为了进一步减少背景荧光，可以使用Image-iT™ FX 信号增强剂作为预封闭步骤，减少由偶联物上的染料和细胞组分之间电荷的相互作用引起的非特异性标记。
• 如果您使用二抗，确保抗体的种属与样品不同。例如不要对小鼠组织使用抗小鼠二抗。
• 滴定测定抗体浓度，使用能获得充足的信号的最低浓度。
• 试试荧光标记的一抗，因为它应会降低背景干扰，但这样做也会降低信号强度。

如果必须进行通透，可以使用共价连接膜里面蛋白的染料，如CellTracker™ CM-DiI。如果使用不与膜里面蛋白共价结合的亲脂性染料进行通透，染料会随着通透去垢剂洗去的脂质一起丢失。

• 请确认您所用的示踪剂交联到蛋白质上，或具有用于固定的伯胺——酰肼、赖氨酸可固定葡聚糖或蛋白质偶联物皆可。
• 使用醛类固定剂交联示踪剂上的胺基。
• 注入更大量或更高浓度的示踪剂。示踪剂通常注射1-20％浓度（10 mg/mL或更高）。
• 确认您使用正确的荧光滤光片进行检测。您可吸取少量未稀释的示踪剂储液滴一滴到载玻片上，然后在显微镜下使用您所需的滤光片观察测试。这可验证示踪剂荧光是否可以被检测到，以及荧光显微镜的滤光片是否工作正常。
• 回顾组织固定和处理步骤，确认是否存在可能影响示踪剂的试剂或处理步骤。

如果您选择的示踪剂是亲脂性染料并且用甲醇固定，脂质会随着甲醇流失。如果您使用甲醇固定，可以选择能够共价结合神经元内的蛋白质的示踪剂。

请确保您使用的是葡聚糖是可固定形式（即包含伯胺）。不包含伯胺的葡聚糖将无法固定。另一个原因可能是葡聚糖的浓度过低，其使用浓度可以增加到10 mg/mL。

如果您想看到最精细的结构，应使用低分子量葡聚糖偶联物，例如3,000 MW葡聚糖偶联物。

如果使用我们的FluoVolt™ 膜电势试剂盒（货号F10488），该试剂盒包含一种背景抑制剂，可改善这一问题。对于其他指标剂，可以考虑使用BackDrop™ 背景抑制剂（货号R37603、B10511和B10512）。

我们的NeuroTrace™ Nissl 染色剂可标记Nissl底物——该底物由与粗面内质网相关的核糖体RNA构成，并大量存在于神经元中。这些染料并非完全特异性靶向神经元，但由于神经元蛋白质的合成水平高而对神经元选择性染色。在某些情况下它们可能会对其他类型细胞（如神经胶质细胞）染色，所以你可能需要降低染色浓度以获得更具选择性的神经元标记效果。对于神经元染色，我们建议的稀释范围是20到300倍。