特殊蛋白质凝胶支持 - 入门

Novex™ Tricine凝胶的推荐保存温度为4℃，在此温度下保质期为4-8周，时间长短取决于凝胶浓度。浓度越高，保质期越短。

Novex™ Tricine凝胶适用于分离多肽和低分子量蛋白（低于10 kDa）。与Tris-甘氨酸凝胶不同，Tricine凝胶可分离分子量低至2 kDa的蛋白质。与甘氨酸(Glycine)不同，三甲基甘氨酸(Tricine)不会干扰测序，所以Tricine凝胶是转印至PVDF膜后直接测序的极佳选择。Tricine凝胶除了具有良好的转印效率，其较低的pH还可将不必要的蛋白质修饰降至最低。Tricine凝胶只能在变性条件下电泳。

Tricine凝胶不含SDS。为了获得最佳电泳效果，Tricine系统要求样品和电泳缓冲液中含有SDS，。Tricine凝胶电泳使用Tricine SDS样品缓冲液和Tricine SDS电泳缓冲液。

Tricine凝胶包含长度约为8-9 mm的4%浓缩胶。

Tricine凝胶中丙烯酰胺：双丙烯酰胺的比值为37.5:1，交联剂的比例为2.6%。

Tricine凝胶系统于1987年被Schagger和von Jagow首次描述，是Laemmli Tris-甘氨酸系统的改良版，对较小的蛋白质和多肽具有较好的分离效果。在Laemmli系统中，蛋白质“堆积”在多孔的上半部分凝胶（浓缩胶）中，并存在于由凝胶缓冲液提供的高迁移率的“先导”氯离子与电泳缓冲液中提供的慢低泳动率的“尾随”甘氨酸离子边界之间。这些堆积的蛋白质条带在到达分离胶后开始筛分，根据大小进行分离。但是，浓缩胶中十二烷基硫酸盐（DS）离子（来自SDS样品和电泳缓冲液）的连续积累会阻碍较小蛋白质（低于10 kDa）的分离。DS堆积可导致DS离子与较小蛋白质发生对流混合，导致条带模糊和分辨率降低。DS离子与较小蛋白质的混合也会干扰后续的固定和染色步骤。

为解决该问题，我们提供了以Schagger和von Jagow 改良的Tris-甘氨酸系统为基础而开发的Novex™ Tricine凝胶系统。这种改进系统采用低pH的凝胶缓冲液，并使用移动更快的三甲基甘氨酸代替甘氨酸作为尾随离子。很多在Tris-甘氨酸系统中随着堆积的DS微粒迁移的小蛋白质和多肽在Tricine凝胶系统中可以很好地与DS离子分离，得到更加清晰的条带和更高的分辨率。

不含有，三甲基甘氨酸实际上来自于电泳缓冲液。

可以。与甘氨酸不同，三甲基甘氨酸不会干扰测序试剂。

在SDS发挥的变性作用不充分时，向样品和电泳缓冲液中加尿素，与SDS共同作用，可能会改善样品的溶解性。这必须经过对目标蛋白质的经验验证。

不同上样孔规格的凝胶的推荐上样体积和蛋白质上样量见Novex™预制胶电泳指南第8页。

Tricine凝胶转印时，我们推荐使用含20%甲醇的1X Tris-甘氨酸转膜缓冲液。Tris-甘氨酸转膜缓冲液可干扰蛋白质测序。因此，如果您想进行蛋白质测序，我们推荐使用无甘氨酸的转膜缓冲液，如1X NuPAGE™转膜缓冲液、0.5X TBE转膜缓冲液或CAPS缓冲液（（10mM CAPS（3-环己胺，1-丙磺酸），10%甲醇，pH 11.0）。

Novex 10% Zymogram明胶凝胶是以0.1%源自猪皮的A型明胶（Sigma货号G2500）为底物的10% Tris-甘氨酸凝胶。

Novex™ 12% Zymogram酪蛋白凝胶是以0.05%酪蛋白为底物的12%Tris-甘氨酸凝胶。酪蛋白的大小约为26 kDa。所使用的酪蛋白类型是保密的。

Novex™ 4-16% Zymogram蓝色-酪蛋白凝胶是以0.1%酪蛋白（与独特的染料共价结合）为底物的4–16%Tris-甘氨酸凝胶。酪蛋白的大小约为26 kDa。所使用的酪蛋白类型是保密的。染料使观察更方便，无需对凝胶染色。

我们的Zymogram凝胶不含SDS。我们推荐选择Novex™ Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液和Novex™ Tris-甘氨酸SDS电泳缓冲液与这些凝胶一起使用。推荐酶活检测使用Novex™ Zymogram复性缓冲液和Novex™ Zymogram孵育缓冲液。

Zymogram凝胶中丙烯酰胺：双丙烯酰胺的比值为37.5:1，交联剂的比例为2.6%。

不同上样孔规格的凝胶的推荐上样体积和蛋白质上样量见Novex™预制胶电泳指南第8页。

包含，Zymogram凝胶包含长度约为8-9 mm的4%浓缩胶。

Zymogram凝胶的浓缩胶部分不含底物（明胶或酪蛋白），但在凝胶灌制过程中可能有少量混入。

我们推荐将Zymogram凝胶保存在4℃。

Zymogram凝胶在4℃下可有效保存8周。

Zymogram缓冲液应保存在4℃。

Novex™ Zymogram凝胶是对以酪蛋白或明胶为底物的蛋白酶进行检测和表征的良好工具。在SDS条件下，蛋白酶可在含有上述任意一种底物的凝胶上进行电泳。经过简单的复性和染色程序，蛋白酶在黑色背景下呈现为透明的条带。这些凝胶通常可用于检测基质金属蛋白酶——一个与癌症和一些炎性疾病发病机制相关的酶蛋白家族。

基质金属蛋白酶（MMPs）的底物包括：

MMP-1：组织胶原酶：胶原蛋白1、2、3、4、6和10

MMP-2：明胶酶：明胶、胶原蛋白4、5和7

MMP-3：基质分解素2：酪蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和弹性蛋白/p>

MMP-7：基质溶解因子：酪蛋白

MMP-8：中性粒细胞胶原酶：胶原蛋白

MMP-9：4型胶原酶：明胶

MMP-10：基质分解素2：酪蛋白

MMP-12：金属弹性蛋白酶：弹性蛋白

不应该，样品不应加热或还原，以便复合蛋白酶能以单个单位的形式迁移，便于电泳后复性。样品应包含一半样品和一半2X Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液。先将样品在室温下放置10分钟，然后再上样。

Zymogram凝胶本质上是含有底物的Tris-甘氨酸凝胶。蛋白质标准品的电泳只取决于丙烯酰胺的比例，因此在两种凝胶上的电泳应该是相同的。但是，如果标准品是预染色的，则蛋白质会由于Zymogram凝胶的染色（或预染色）而呈现为不同的颜色。

我们决定使用0.05%酪蛋白，是因为这样可使灵敏度更高。0.1%酪蛋白和0.2%酪蛋白可使条带对比度更高，但灵敏度较低，这是因为酶需要消化更多的底物才能形成清晰的条带。

4-16% Zymogram蓝色-酪蛋白凝胶中的酪蛋白与染料共价结合。一些酶消化与染料结合的酪蛋白比消化未经修饰的酪蛋白需要更长的时间，同时，清除更大量的酪蛋白需要消耗更多活性。

可使用Colloidal Blue染料或SimplyBlue™ SafeStain对Zymogram凝胶进行染色。无需固定步骤。我们推荐在复性和孵育凝胶以获得酶活性后，使用SimplyBlue™ SafeStain染色。如果在检测活性较弱的酶时需要更高的对比度，可使用0.5% Coomassie™ R250染料。

NativePAGE™ 5% G-250样品添加剂（货号BN2004）是一种浓缩型Coomassie™ G-250储液，专为与含有洗涤剂（非离子型）的NativePAGE™凝胶电泳样品一起使用而设计。NativePAGE™ 5% G-250样品添加剂的具体成分保密。该添加剂不含洗涤剂。

NativePAGE™ 5% G-250样品添加剂是一种Coomassie™ G-250的浓缩型储液，专为与含有洗涤剂（非离子型）的NativePAGE™凝胶电泳样品一起使用而设计。正常情况下，非变性蛋白在凝胶上的迁移取决于凝胶缓冲液pH下的自然电荷/等电点，但是，加入Coomassie™ G-250会使蛋白质产生一个关联后的负电荷，即使是通常具有正电荷的高pI蛋白质也能带上负电。该添加剂能够与蛋白质非特异性结合，无需变性。NativePAGE™ 5% G-250样品添加剂应加入到阴极缓冲液中，也可加到样品中。

NativePAGE™凝胶包含浓缩胶。这类凝胶的浓缩胶长度约为1cm，位于凝胶顶部，这一部分的丙烯酰胺比例较低（4%）且恒定。在浓缩胶下方的分离胶中，丙烯酰胺比例增加。但是，整个凝胶的凝胶缓冲液是相同的。所以，NativePAGE凝胶的浓缩胶不同于Laemmli系统，后者的浓缩胶具有不同的pH，导致尾随离子的迁移率降低。此外，整个NativePAGE凝胶是一次性连续灌制而成，因此，其分离胶与浓缩胶之间无界限。

不同上样孔规格的NativePAGE™的推荐样品上样体积和蛋白质上样量见NativePAGE™ Novex™ Bis-Tris凝胶系统使用手册第3页。

我们推荐将其保存在4-25℃。不可冷冻。

NativePAGE™ Novex™ Bis-Tris凝胶的分离范围较宽，覆盖全部低分子量和高分子量范围：

• NativePAGE™ Novex™ 3–12% Bis-Tris凝胶可分离分子量在30–10,000 kDa范围内的蛋白质。
• NativePAGE™ Novex™ 4–16% Bis-Tris Gels凝胶可分离分子量在15–10,000 kDa范围内的蛋白质。

NativePAGE™样品缓冲液和电泳缓冲液专为与NativePAGE™ Bis-Tris凝胶一起使用而设计。我们不推荐将这些缓冲液用于任何其他凝胶（包括NuPAGE™ Tris-Acetate凝胶或Novex™Tris-甘氨酸凝胶）的非变性应用。对于那些凝胶，我们推荐使用Novex™ Tris-甘氨酸系统的非变性样品缓冲液和电泳缓冲液。

我们不推荐将NativePAGE™样品缓冲液和电泳缓冲液与NuPAGE™ Bis-Tris凝胶一起使用。NuPAGE™ Novex Bis-Tris凝胶经优化可用于变性条件，具有极低的工作pH（pH 7.0），大部分蛋白质难以在非变性条件下在该凝胶中迁移。

需要使用非离子洗涤剂进行增溶的样品不能兼容传统的非变性Tris-甘氨酸PAGE，因为随着蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移，会将非离子洗涤剂遗留在后方。当缺少非离子洗涤剂时，蛋白质会聚集并在泳道顶部形成垂直线条。当使用蓝色非变性电泳（NativePAGE™凝胶）时，Coomassie™ G-250可显著减少蛋白质的聚集，分离膜上的蛋白质复合物，达到Tris-甘氨酸凝胶上得不到的效果。

此外，与Tris-甘氨酸系统的工作pH（pH 9.3–9.5）相比，NativePAGE™凝胶较低的工作pH（pH 7.5–7.7）有助于维持碱性pH敏感型蛋白质的非变性结构和/或活性。

NativePAGE™凝胶已被成功用于EMSA，对2种纯化蛋白质间的相互作用进行分析。但是，我们尚未测试将NativePAGE™凝胶用于EMSA以分析核酸（DNA或RNA）与蛋白质或蛋白质复合物间的相互作用。

我们推荐使用NativeMark™未染色蛋白质标准品，货号LC0725。

不能，我们大部分蛋白质标准品（包括Novex™ Sharp预染和未染色标准品）是经过变性和还原的，在非变性凝胶上不能良好分离。对于NativePAGE™电泳，我们提供了NativeMARK™未染色蛋白质标准品（货号LC0725）。这是一款即用型蛋白质标记物，可在非变性凝胶电泳中用于估计蛋白质的分子量。

请注意，即使使用非变性标准品，在非变性电泳中的分子量预估也是非常不精确的，因为各蛋白质的不同电荷和结构会严重影响凝胶迁移。为获得更精确的预估，可使用SDS-PAGE分离或质谱分析。

NativePAGE™ Novex™ Bis-Tris凝胶可兼容大多数标准Coomassie™ R-250或G-250染料配方。对于NativePAGE™凝胶中最敏感的Coomassie™染色，推荐使用Novex™ Colloidal Blue染色试剂盒（货号LC6025）。由于SimplyBlue™ Safe Stain（货号LC6060）有特殊的固定需求，因此不推荐将其用于NativePAGE™凝胶。SilverQuest™银染试剂盒（货号LC6070）和SilverXpress™银染试剂盒（货号LC6100）均适用于NativePAGE™凝胶染色。但是，为获得最佳的总体效果和更低的背景，我们建议最好使用SilverQuest™试剂盒。

我们推荐选择NuPAGE™转膜缓冲液用于NativePAGE™凝胶转印。PVDF是推荐使用的印迹膜，具有良好的转印和检测效果。硝酸纤维素不能兼容NativePAGE™凝胶转印，这是因为硝酸纤维素膜可与Coomassie™ G-250染料发生紧密结合，并且不能兼容用于膜脱色和固定蛋白质的含酒精溶液。

适用，请参考使用iBlot™干转系统进行NativePAGE™ Bis-Tris凝胶免疫印迹分析的应用指南。

尽管凝胶的主要化学成分相同，但它们是不可交换使用的。NuPAGE™ Bis-Tris凝胶经过优化可用于变性和还原条件，这类凝胶的中性pH使其难以用于非变性应用，因为大部分蛋白质无电荷或具有正电荷。因此，不推荐将这类凝胶用于非变性应用。此外，NativePAGE™ Bis-Tris凝胶的配方不同，其经过优化可用于分辨率最高的非变性电泳。两种类型凝胶的缓冲液不可交换使用。

E-PAGE™凝胶是一种自足式预制胶（中型pH），通过将缓冲凝胶基质和电极装入一次性的、可透过紫外光的凝胶盒中制成。该凝胶专为在同一块水平凝胶中实现快速的、少缓冲液的、高通量的蛋白质电泳而设计，具有96孔、6%和48孔、8%两种规格。每块E-PAGE™ 96 6%凝胶含有96个样品泳道和8个蛋白标准品泳道，其独特的交错式孔板能兼容标准96孔板格式，可使用多通道移液器或自动化液体处理系统进行上样。每块E-PAGE™ 48 8%凝胶含有48个样品孔和4个蛋白标准品泳道。可使用多通道移液器在交替的泳道中上样，或使用自动化液体处理系统上样。

E-PAGE™凝胶的配方是保密的。

E-PAGE™凝胶不含防腐剂。它们在生产过程中经过紫外消毒。

E-PAGE™ 96 6%和E-PAGE™ 48 8%凝胶上每条泳道的电泳距离分别为1.6 cm和3.2 cm。

E-PAGE™凝胶含有SDS，推荐将其用于变性条件下的电泳。

E-PAGE™凝胶每个泳道的推荐上样量是1–20 μg蛋白质。每个泳道的最大推荐蛋白质上样量是20 μg。过多的蛋白质会导致分辨率较差和拖尾效应。

E-PAGE™ 48和E-PAGE™ 96凝胶的推荐总上样体积为15µL（最多20µL）。上样体积太小会导致分辨率较差和拖尾效应。为实现较好的条带分离，我们推荐保持样品间体积均一，并在空孔中加入去离子水。

我们推荐使用4X E-PAGE™上样缓冲液1（与E-PAGE™凝胶一起提供）制备用于SDS-PAGE电泳和凝胶染色或转印的样品。我们不推荐使用任何其他SDS样品缓冲液，如NuPAGE™ LDS样品缓冲液和Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液，否则可能导致条带分辨率降低。

我们推荐使用Lumio绿色检测试剂盒中提供的Lumio凝胶样品缓冲液进行胶内检测。不建议使用E-PAGE上样缓冲液。Lumio融合蛋白显色时，无需从凝胶盒中取出E-PAGE凝胶。

4X E-PAGE™上样缓冲液1的成分是保密的。

请遵循E-PAGE™技术指南第10页中的建议。高盐或高洗涤剂含量的样品可使E-PAGE™凝胶的分辨率降低。

我们推荐使用大型凝胶干燥试剂盒（货号NI2207）进行E-PAGE™凝胶干燥。也可以风干E-PAGE™凝胶。E-PAGE™ 96凝胶至少需要4天才能完全风干。不建议使用真空干燥——这类凝胶的厚度使其非常容易破裂。

E-PAGE™ 96 6%和E-PAGE™ 48 8%凝胶的推荐电泳时间分别为14分钟和25分钟。无需预电泳。可以通过延长电泳时间来改善分辨率，但应注意不要使电泳进入下一个孔。E-PAGE™ 96或48凝胶的电泳时间分别不应超过25和30分钟。电泳功率为9.5瓦特。

请在下表中查看推荐的蛋白质标准品：

Mother E-Base™设备（货号EB-M03）带有可直接连到插座的电源线，用于1块E-PAGE™凝胶的电泳。Daughter E-Base™设备（货号EB-D03）可连接到Mother E-Base™和另一台Daughter E-Base™设备上，用于2块或更多凝胶同时电泳。Daughter E-Base™设备不与电源线连接，不可脱离Mother E-Base™设备而单独使用。测试证明，1台Mother E-Base™最多同时与3台Daughter E-Bases™连接用于电泳。

我们推荐使用iBlot™凝胶转印设备进行E-PAGE™凝胶转印（见E-PAGE™技术指南 第27页）。也可采用半干转（第33页）和半湿转（第37页）。

电泳结束后，可使用Butterfly Opener（与E-PAGE™凝胶一起提供）打开E-PAGE™凝胶盒，从而将凝胶用于免疫印迹分析或染色等下游应用。

E-PAGE™凝胶可兼容多种标准Coomassie™染色、银染或荧光染色方案。E-PAGE™凝胶比大部分SDS-PAGE小型凝胶更厚，所以染色和脱色步骤需要更长时间。我们推荐使用以下染料进行E-PAGE™凝胶染色。E-PAGE™技术指南第40-49页对染色方案进行了详细描述。

总蛋白质染料：

• SYPRO™ Ruby蛋白质凝胶染料（第40页）
• Coomassie™染料（第42页）
• SimplyBlue™ SafeStain（第44页）
• SilverQuest™银染试剂盒（第47页）
• SilverXpress™银染试剂盒（第48页）

专用蛋白质染料：

• Lumio™绿色检测试剂，用于检测Lumio融合蛋白（第40页）
• InVision™ His-tag In-Gel Stain，用于检测6X His标签蛋白（首先推荐转印，第49页）

我们推荐使用EP程序进行E-PAGE™凝胶电泳。

E-Holder™平台专为在上样期间支持E-PAGE™凝胶而设计。在对多块凝胶上样而其他凝胶正在E-Base™设备上电泳时，您可选择使用E-Holder™平台。

注意：E-Holder™平台不是电源装置，不可连接到插座，不可用于E-PAGE™ 48或96凝胶电泳。为了获得最佳结果，应在使用E-Holder™平台上样后15分钟内，使E-PAGE™凝胶在Mother E-Base™设备或Daughter E-Base™设备上开始电泳。

我们建议保持Mother E-Base™设备和Daughter E-Base™设备表面无污染物。清洁设备时，先将基座与电源断开，再用干布擦拭。不要试图打开或维修基座。