细菌表达支持 – 入门

下表比较了4种系统在表达水平、无诱导情况下的基础表达水平（表达渗漏）以及蛋白表达量是否受诱导剂添加量的控制（滴定能力）等方面的差异。

若要在大肠杆菌中同时表达2种蛋白，我们建议使用双启动子载体或同时使用2种不同的可兼容的载体。例如，您可尝试同时使用1个pET载体和1个pRSET载体，它们含有不同的复制起点（ORI），分别为pBR322和pUC复制起点。唯一的问题是，pRSET载体是高拷贝数的，而pET不是；因此，如果您将它们转化到同一个宿主细胞中，从pRSET中得到的蛋白表达可能明显多于pET。

通常使用免疫印迹分析法检测蛋白表达。我们提供许多针对不同表位的抗体，如Xpress™、HisG、V5或C-端6xHis。此外，可以用我们的ProBond™亲和纯化系统来纯化His标签蛋白。

RBS与ATG之间的序列应该为8-12 bp，并且不含有任何回文序列。

不能。尽管可生成转录本，但是没有可起始翻译的核糖体结合位点（RBS）或Shine Dalgarno序列。在大肠杆菌细胞中，mRNA可被转录，但其不会被翻译成蛋白质。

IPTG的用量差异很大，我们通常建议的起始范围为0.1-5 mM IPTG。

诱导时间差异很大。在使用T7系统的实验中，当OD₆₀₀为0.1–1.2时进行诱导，获得了成功的诱导结果。一般来说，在高OD值进行诱导，会产生较低的表达得率，因为细胞密度过高会使细胞立即停止生长。进行诱导的最佳OD₆₀₀为0.4-0.6。

诱导的温度范围很大，可以从37°C到30°C乃至室温。较低温度通常需要较长的生长时间。

T7表达系统使用强力的噬菌体T7启动子可进行高水平表达。该系统依赖于T7 RNA聚合酶。尽管该聚合酶不是细菌内源产生的，但一些大肠杆菌菌株（如BL21（DE3）和BL21（DE3）pLysS）经过基因工程改造已携带可编码该RNA聚合酶的基因，称之为DE3噬菌体λ溶原菌。该λ溶原菌含有lacl基因、受lacUV5启动子控制的T7 RNA聚合酶基因以及一小部分lacZ基因。这个lac基因被插入到int基因中，从而使其失活。破坏int基因可防止在缺乏辅助噬菌体的情况下发生噬菌体切割（即，溶菌）。lac阻遏物可抑制T7 RNA聚合酶的表达。因此，当这些细胞处于正常情况时，lac阻遏物（lacl产物）结合到 lacUV5启动子与编码T7 RNA聚合酶的基因之间的lac操纵子区域。这有效阻止了T7 RNA聚合酶基因的转录。当然，总会存在少量的基础表达水平的T7 RNA聚合酶。这是因为lac阻遏物与lac操纵子区域处于平衡状态，使操纵子位点大部分被占据，但并不是一直被占据。

加入可阻止lac阻遏物与lac操纵子结合的化合物后，可诱导蛋白质表达。该化合物为异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）。IPTG与lac阻遏物结合，改变其构象，从而使其不能与lac操纵子结合。这会导致细胞大量生成T7 RNA聚合酶。由于T7 RNA聚合酶对T7启动子（仅存在于转化质粒中）具有特异性，质粒编码的蛋白将发生过表达。

有多种因素可影响表达，包括：

• 诱导剂（IPTG）的加入量
• 诱导的开始时间点（进行诱导的最佳OD₆₀₀值为0.4-0.6）
• 诱导持续时长
• 诱导温度
• 载体本身

尽管可生成转录本，但是没有可起始翻译的核糖体结合位点或Shine Dalgarno序列；因此，不会生成蛋白质。

T7启动子表达系统通常可产生相当高的得率，可轻松进行放大。得率取决于所表达的蛋白，范围通常为每升培养物可得到100 µg至10 mg蛋白。

可以。实际上，羧苄青霉素通常比氨苄青霉素更稳定，可防止pET质粒的丢失从而可能会有助于增加蛋白表达水平。

T7和Champion™ pET表达载体都具有强力的噬菌体T7启动子。使用IPTG诱导后，T7 RNA聚合酶会与T7启动子结合，使目的基因发生转录和翻译。研究表明，即使在无诱导剂的情况下，也一直会存在一些由λDE3溶源菌中lacUV5启动子介导的T7 RNA聚合酶基础表达（Studier and Moffatt, 1986）。通常，这不会带来问题，但是，如果目的基因对大肠杆菌宿主具有毒性，则目的基因的基础表达可能会导致质粒不稳定和/或细胞死亡。为解决这个问题，经过设计的Champion™ pET 载体含有T7lac启动子，可驱动目的基因的表达。T7lac启动子包含T7 启动子及其下游的lac操纵子序列。lac操纵子作为lac阻遏物（由lacl基因编码）的结合位点，可进一步抑制BL21 Star™（DE3）细胞中由T7 RNA 聚合酶诱导的目的基因的基础转录。

我们推荐Champion™ pET SUMO蛋白表达系统（货号K300-01）。将目的基因克隆和表达为融合有SUMO标签的蛋白。使用SUMO蛋白酶切割SUMO，可得到在切割位点与蛋白起点之间无残余氨基酸的天然蛋白质。

pTrc系统中的pTrc启动子是一种强杂合启动子，由trp启动子的-35区域和lacUV5启动子/操纵子的-10区域构成。pTrc表达受Lacl蛋白抑制，受IPTG诱导。

一种被称为CAP（代谢产物活化蛋白）的转录激活蛋白，通常可结合到trc启动子的上游并激活转录。该蛋白需要cAMP才能与DNA结合。在培养基中加入葡萄糖可降低细胞内cAMP水平。在LB培养基和琼脂板中补充葡萄糖，会抑制trc启动子的基础水平转录。为确保插入片段的稳定性，我们建议您在选择培养基中加入25 mM或0.5%葡萄糖。

pTrc启动子可被大肠杆菌RNA聚合酶识别，而不是T7聚合酶，因此，pTrc启动子可在任何大肠杆菌菌株中表达，而不仅仅是BL21菌株。所以，您可使用Top10、DH5α™等进行表达。但是，如果您的目的基因具有毒性，则会因表达渗漏而出现克隆困难。

pBAD表达系统可通过调控特定碳源，如葡萄糖、甘油和阿拉伯糖，可实现严格的蛋白表达调控，表达量可调节。pBAD非常适用于在大肠杆菌中表达毒性蛋白质以及优化蛋白质溶解性。该系统有助于使蛋白生成水平恰好低于其不溶解的阈值。pBAD载体利用大肠杆菌阿拉伯糖操纵子的调控元件，可精确调节异源表达水平，从而优化目的蛋白产量。pBAD载体骨架上具有调节蛋白AraC，可实现对pBAD的调控。

使用pBAD表达系统时，我们推荐使用L-阿拉伯糖来调节目的基因的表达。当存在L-阿拉伯糖时，可诱导pBAD的表达，而缺乏L-阿拉伯糖时，会产生非常低的pBAD转录水平(Lee, 1980; Lee et al., 1987)。

araC基因产物可正负调控BL21-AI™中用于控制T7 RNA聚合酶表达的araBAD启动子（pBAD）（Ogden et al., 1980; Schleif, 1992）。AraC是一种转录调节因子，可与L-阿拉伯糖形成复合物。当缺乏L-阿拉伯糖时，AraC二聚体与araBAD操纵子的O2和I1半位点接触，形成一个210 bp的DNA环（见下图）。实现最大程度的转录激活，需要2个条件。

• L-阿拉伯糖与AraC结合，使蛋白质释放O2位点并结合I1位点相邻的I2位点。这会释放DNA环，开始转录。
• cAMP激活蛋白（CAP）-cAMP复合物与DNA结合，刺激AraC与I1和I2的结合。

请注意，在生长培养基中加入葡萄糖会抑制基础表达水平。葡萄糖发挥作用是通过降低cAMP水平，进而减少CAP的结合。cAMP水平的降低，会减少转录活性。

pBAD载体含有正向和反向pBAD引物，位于目的基因上下游。这些序列如下：

pBAD正向引物：5’-ATGCCATAGCATTTTTATCC-3’

pBAD反向引物：5’-GATTTAATCTGTATCAGG-3’

我们建议使用基因型为araBADC-和araEFGH+的感受态细胞株，这种细胞可转运L-阿拉伯糖，而不会将其代谢。这对于表达研究很重要，因为在细胞内的L-阿拉伯糖水平是恒定不变的，不会随时间降低。我们可提供我们的TOP10感受态细胞或LMG194大肠杆菌菌株。

请查看使用TOP10或LMG194的优点和缺点：

L-阿拉伯糖的用量取决于您的表达实验，我们建议在初试表达试验中采用多种不同用量的L-阿拉伯糖，范围为0.00002%至0.2%。

BL21细胞均来源于B834菌株，因此是B菌株。

我们尝试使用过的最大质粒为16kb。但是，从理论上来说，在效率开始下降之前，您可能可以转化高达30kb的质粒。

在所有BL21（DE3）细胞株中，T7 RNA聚合酶总是存在一些基础水平表达（请注意BL21 AI细胞株除外）。如果毒性基因被克隆到T7启动子的下游，则这个毒性基因的基础表达可能导致生长率降低、细胞死亡或质粒不稳定。利用含有可编码T7溶菌酶的基因以及普通DE3元件的细胞株，可避免出现上述问题。T7溶菌酶已被证明可与T7 RNA聚合酶结合并抑制转录。这种活性能够降低T7 RNA聚合酶的基础水平。在IPTG的诱导下，lac阻遏物不再与lac操纵子区域结合，从而可生成T7 RNA聚合酶。T7 RNA聚合酶生成水平增加并超出了少量T7溶菌酶蛋白有限的抑制T7 RNA聚合酶的能力，导致目的基因表达。使用BL21-AI细胞株，也可避免毒性蛋白的基础表达（详情见下文）。T7溶菌酶是一种双功能酶，它除了具有T7 RNA聚合酶结合活性，还可切割大肠杆菌细胞壁肽聚糖层的特异键。这种活性可增强纯化前冻融循环产生的细胞裂解作用。

当未携带pLysS质粒的宿主生长至稳定期（16 hr；过夜培养）并且目的基因具有毒性时，将基础表达降至最低，对pET载体的表达尤为重要。当没有来自pLysS质粒的T7溶菌酶时，稳定期培养物中的基础表达水平会升高。如果目的基因具有毒性，为了维持质粒的稳定性，可能有必要在液体培养基和琼脂板中加入0.5–1%葡萄糖。在生长至稳定期的培养物中，含有pLysS的宿主表达溶菌酶的水平升高，从而降低目标蛋白的诱导水平。这可能是因为氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因启动子在缺乏葡萄糖的情况下对cAMP刺激也具有敏感性，并且氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因启动子位于pLysS T7溶菌酶基因的上游。

渗漏表达是指存在一些基础水平表达。例如，在所有BL21（DE3）细胞株中， T7 RNA聚合酶总是存在一些基础水平表达。如果毒性基因被克隆到T7启动子的下游，则这种“渗漏表达”可能导致生长率降低、细胞死亡或质粒不稳定。

BL21 (DE3) pLysS和BL21 (DE3) pLysE两种细胞株均含有T7溶菌酶。下表总结了这两种细胞株的一些关键特性。

BL21-AI细胞株的构建是通过在阿拉伯糖诱导型araBAD启动子的控制下插入一个T7 RNA聚合酶基因（T7 RNAP）染色体拷贝而实现的。BL21-AI细胞株不含有可被IPTG诱导的(DE3)溶源菌。因此，您可利用含有lac/tac启动子的载体进行蛋白表达。

BL21 (DE3) Star™细胞中编码RNase E (rne131) 的基因存在突变，RNase E (rne131) 是与大肠杆菌中mRNA降解相关的主要酶之一。该突变可显著改善mRNA转录本的稳定性，从而增加具有普通T7启动子的细胞株（如BL21 (DE3)）的蛋白表达得率。由于T7 RNA聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶更快，因此，T7启动子的转录与翻译步骤并不同步，导致大量无保护的mRNA转录本留在细胞中。这些无保护的mRNA对内源性RNase的酶降解较为敏感，可大幅降低蛋白得率。BL21 Star™细胞株中编码RNase E (rne131) 的基因存在突变，RNase E (rne131) 是与大肠杆菌中mRNA降解相关的主要酶之一。该突变可显著改善mRNA转录本的稳定性，从而增加蛋白产量。

我们建议使用TOP10或与其相似的细胞株，如DH5α™，进行融合、繁殖和维持研究。即使是无诱导剂的情况下，基础水平的T7聚合酶，也会导致目的基因发生表达。如果目的基因对大肠杆菌宿主具有毒性作用，则可导致质粒不稳定和/或细胞死亡。此外，BL21细胞是endA和recA野生型的，这使其成为一种难以繁殖和维持的宿主细胞株。

我们建议您在获得正确的构建质粒后，将克隆以甘油储液的形式进行保存。请遵循以下步骤来制备甘油储液：

• 在含有50-100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，使1-2 mL菌株生长至饱和（12-16小时；OD₆₀₀ = 1-2）
• 取0.85 mL培养物，与0.15 mL无菌甘油混合。
• 通过涡旋，混合溶液。
• 转移至合适的冻存管中，盖上管帽。
• 在乙醇/干冰浴或液氮中冷冻，然后转移至–80°C长期保存。

DE3是指菌株含有λ DE3溶源菌，其染色体上带有由lacUV5启动子控制的T7 RNA聚合酶基因。lacUV5启动子受内源性大肠杆菌lacl蛋白的调控，可被IPTG诱导。诱导T7 RNA聚合酶的表达需要IPTG。DE3 λ衍生株也含有噬菌体21的免疫性区域。

BL32-AI™: F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm araB::T7RNAP-tetA

BL21-AI™菌株是一种离子蛋白酶和外膜蛋白酶OmpT缺陷型大肠杆菌表达株。缺少这些蛋白酶可减少该菌株中表达蛋白的降解。该菌株在染色体araB位点插入了含有T7 RNA聚合酶和tetA基因，可表达这两个由araBAD启动子调控的基因。tetA基因的存在导致细胞株具有四环素抗性，利用四环素可对菌株特性进行验证

当出现以下任何一种情况时，即可假定蛋白可能具有毒性：

1. 转化并在培养板上生长后未获得菌落，或培养板上出现大大小小、不规则的菌落。
2. 起始液体培养物不生长。
3. 起始培养物按1:20稀释后，表达培养物OD600达到0.4所需的时间超过5小时。
4. 使用L-阿拉伯糖（或L-阿拉伯糖和IPTG）诱导后，细胞裂解。

MagicMedia™培养基是一种大肠杆菌表达培养基。它可使蛋白得率提高3-10倍，可用于含有功能性lac操纵子的T7调控型大肠杆菌载体和BL21 (DE3) 菌株，易于操作，并且可省去OD监测/诱导步骤。

很遗憾，MagicMedia™培养基不能与阿拉伯糖诱导剂一起工作。MagicMedia™培养基需要IPTG诱导系统和完整的Lac操纵子。

可以，使用双温度表达方案已经验证过在18°C和25°C表达。