细菌表达支持 – 问题排查

请查看以下关于无菌落生成的可能原因和建议：

• 检查所用的抗生素
• 转化pUC19对照载体，检验感受态细胞。
• 如果目的基因具有毒性，并且启动子为T7启动子，可尝试使用BL21 (DE3) (pLysS)或(pLysE)或BL21 (AI)感受态细胞。您也可尝试在培养基中加入葡萄糖。

• 降低诱导温度至30°C、25°C或18°C，有助于增加溶解性和减少包涵体形成。温度越低，诱导所需时间越长（即，30°C需3-4小时，25°C需3-5小时，18°C需过夜）。
• 在较高温度下生长（30°C或37°C）并达到合适的OD，加入诱导剂，然后降低温度。
• 尝试不同剂量的IPTG（1 mM-0.1 mM IPTG）。
• 使用低拷贝数的质粒。
• 使用营养不丰富的培养基，例如以M9基本培养基代替LB。
• 如果蛋白质需要辅因子，如金属，则在培养基中加入辅因子。
• 增加葡萄糖至1%。
• 尝试使用BL21-AI菌株并使用不同剂量的阿拉伯糖。

请访问我们的克隆支持中心，获取关于限制性内切酶克隆、Gateway克隆或PCR （TOPO/blunt/等）克隆的信息。

请查看以下可能的原因和解决方案：

• 载体中存在移码或提前终止密码子；应检查序列。
• 使用了错误的菌株进行表达。
• 使用甘油菌可能会改变质粒的完整性，因为大多数用于表达的菌株基因型不是RecA-和EndA-。应使用新鲜转化的细胞。
• 蛋白质存在于不溶的组分中；应检查细胞裂解物，而不仅是上清液。
• 目的基因使用了稀有密码子——检查所用密码子。
  （http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC）
• 在培养过程中，细胞剔除了质粒——这在氨苄青霉素抗性质粒中较为常见。尝试在培养基中使用羧苄青霉素代替氨苄青霉素；接种前，使用含新鲜氨苄青霉素/羧苄青霉素的LB培养基清洗和重悬过夜培养物。

当您的目的基因具有毒性时这种情况很常见。尝试使用更严格调控的系统，如BL21 (DE3) (pLysS)或BL21 (DE3) (pLysE)或BL21(AI)。

使用新鲜的细菌培养物进行接种，因为新鲜的细菌菌落通常可得到较高的蛋白得率。

检查重组蛋白序列中的不常用密码子。利用常用密码子代替稀有密码子，可显著提高表达水平。例如，精氨酸密码子AGG和AGA是大肠杆菌的不常用的密码子，所以这些密码子的tRNA水平低。

进行蛋白纯化时，在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，如PMSF。使用新鲜配制的PMSF，因为PMSF被稀释到水溶液中后30分钟内会失效。

如果您在表达实验中使用氨苄青霉素进行筛选，则可能会因为筛选条件缺失而出现质粒不稳定。这是因为氨苄青霉素被β-内酰胺酶破坏，或者在由细菌代谢物造成的酸性培养基条件下发生水解。在转化和表达实验中，可使用羧苄青霉素替代氨苄青霉素。

重组蛋白可能对细菌细胞具有毒性作用。应选择更严格调控的系统用于表达，如BL21-AI。也可考虑尝试使用不同的表达系统，如pBAD系统。

如果存在溶解性问题，可尝试在诱导时降低温度或减少IPTG用量。也可尝试使用不同的、更严格的菌株进行表达。此外，在表达期间，也可将细菌培养基的葡萄糖含量增加至1%。

通常，如果您看见1-2条主带，则表示密码子使用偏好导致了翻译过早终止。发生降解时，通常可看到梯度条带。发生降解时，可尝试在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂有助于防止降解。如果是这种情况，可通过时间点实验来确定收细胞的最佳时间。