哺乳动物表达基础支持 – 问题排查

我们推荐您在基因序列之后和表位标签之前插入一个终止密码子，这样表位标签就不会表达了。

即使缺乏Kozak序列，翻译也还是会在核糖体遇到的第一个ATG处启始，不过启始效率可能相对较低。只要处于最初ATG的阅读框内，任何下游的插入序列都可能表达为融合蛋白，不过如果这里没有Kozak保守序列，则蛋白的表达水平预期会比较低。如果载体中包含一个非Kozak型的保守ATG，我们则推荐您将基因克隆至该ATG上游，再包含一个Kozak序列来优化表达效果。 

不可以；新霉素对哺乳动物细胞有毒性。我们推荐您使用Geneticin（又称 G418硫酸盐)，这一产品的毒性较低，是在哺乳动物细胞中进行有效筛选的新霉素的替代品。

这里列举了一些可能的原因与解决方案：

• Try the control expression that is included in the kit

• 可能的检测问题：
  • 检测瞬转的表达蛋白可能有难度，因为转染效率可能过低，以致用于整个转染群体的评估手段无法成功实现检测。我们推荐您通过稳转筛选或采用能够逐个检测单一细胞的技术手段来优化您的转染操作。您也可尝试通过改变启动子或细胞类型来提高表达水平。
  • 细胞中的蛋白表达水平对于所选择的检测方法来说可能过低。我们推荐您优化检测方案或寻找更为灵敏的方法。如果使用考马斯亮蓝染色/银染法检测过该蛋白，我们则推荐您使用免疫印迹法来增加检测灵敏度。裂解产物中存在的内源蛋白可能会在考马斯亮蓝染色/银染过程中掩盖目的蛋白。如果可能，我们推荐您在免疫印迹实验中包括一个阳性对照。

• 蛋白可能降解或截短了：使用Northern杂交进行检测。
• 可能的时程问题：由于蛋白表达随时间延长而发生的变化依赖该蛋白的天然属性，我们一般推荐您先获取一份表达的时程曲线。尝试进行一次时程分析将帮助您确定最优的表达时间窗。
• 可能的克隆问题：通过限制性酶切和/或测序来验证克隆。

这里列举了一些可能的原因与解决方案：

• 所用检测法可能不适当或不够灵敏：
  • 我们推荐您优化检测方案或寻找更为灵敏的方法。如果使用考马斯亮蓝染色/银染法检测过该蛋白，我们则推荐您使用免疫印迹法来增加检测灵敏度。裂解产物中存在的内源蛋白可能会在考马斯亮蓝染色/银染过程中掩盖目的蛋白。如果可能，我们推荐您在免疫印迹实验中包括一个阳性对照。
• 筛选到的克隆数不够：至少筛选出20个克隆。
• 在稳转筛选中使用了不适当的抗生素浓度：请确保正确获取了抗生素的杀死曲线。由于某一既定抗生素的效力依赖于细胞类型，血清，培养基和培养技术，因此必须在每次进行稳定筛选的时候确定抗生素的用量。如果采用的培养基或血清条件明显不同，则即使是我们所提供的稳转细胞系对于我们推荐的剂量也可能出现更敏感或更不敏感的情况。
• 基因产物（即使低水平）的表达可能与该细胞系的生长不相容（如毒性基因）：使用一个可诱导的表达系统。
• 阴性克隆可能由基因表达的关键载体位点处优先发生了线性化所致：在一个不影响表达的位点实施载体线性化，如在细菌抗药性标志物序列中。

我们推荐您同时检查细胞裂解产物和培养基中是否存在目的蛋白。尽管既定的分泌信号序列适用于绝大多数蛋白的分泌表达，但并不能保证适用于所有蛋白。因此，有必要通过实验来确定目的蛋白是不是正确分泌出来了。

与限制性酶切克隆相关的问题，请访问我们的限制性酶切克隆支持中心。与TOPO载体克隆相关的问题，请访问我们的PCR克隆支持中心；与Gateway载体克隆相关的问题，请访问我们的Gateway重组与无缝克隆支持中心。

几乎所有批次的FBS中都含有四环素，因为FBS通常从奶牛中获得，而它们的饮食中有四环素。如果细胞培养于含有未去除四环素的FBS的培养基中时，目的基因就会出现低水平的基底表达情况，即使用户未主动添加四环素。在这一情况下，我们推荐您购买我们的Gibco细胞培养低四环素含量的FBS。为了确保四环素的清除效果，这些批次产品中四环素的含量应低于19.7 ng/mL（这一数值应为分析检测阈值）。

注意：Tet-抑制子蛋白与四环素的结合常数为3 nM。假设培养基中含有10%的血清，而血清中四环素的浓度为19.7 ng/mL，则相当于4 nM的四环素。因此请记得，即便使用了低四环素的FBS，仍有可能存在本底水平的表达。

在放弃之前，我们推荐您尝试使用pFRT/lacZeo2载体来建立您的宿主细胞系。这一载体包含了截短型的SV40启动子的，它驱动了lacZ-Zeocin融合蛋白的表达。使用这一载体能够帮助用户分离出那些整合在增强子附近的克隆，从而获得更高的目的基因表达效果。

Flp-In^TM 3T3细胞系源自于NIH3T3细胞，后者是小鼠的成纤维细胞。CMV启动子在小鼠细胞系中已知会随时间延长而逐渐沉默，因此我们推荐您在这类细胞系中使用那些包含非CMV型启动子的Flp-In^TM表达载体，如pEF5/FRT/V5-D-TOPO载体或pEF5/FRT/V5-DEST载体。

我们在内部实验中发现，当FRT位点整合进入具有高度转录活性的宿主细胞基因组位点中时（在Flp-In^TM CHO与Flp-In^TM 293细胞中更为常见，但也出现于Flp-In^TM 3T3细胞及其他任何Flp-In^TM宿主细胞系中），就会出现一些“读通（read-though）”的转录现象，并在Flp-In^TM反应后翻译出lacZ-Zeocin ORF——即使lacZ-Zeocin ORF未包含真正的启动子和ATG起始密码子。在这一情况发生时，潮霉素抗性克隆就可能同时出现lacZ阳性和Zeocin^TM抗生素耐受性。为了确保FRT实现了位点特异性整合而非随机整合，我们推荐用户在无pOG44存在的条件下开展平行的对照转染实验。这一对照组在潮霉素筛选过程中应不存在存活的克隆，表明在pOG44存在条件下获得的所有潮霉素抗性克隆确实为Flp重组酶依赖克隆，因此确定目的基因确实有效整合进入了FRT位点。另外，针对这些克隆进行Southern杂交分析也能够帮助用户验证目的基因确实发生了准确的FRT整合，尽管lacZ也出现表达（尽管通常情况下这是不必要的）。在Flp-In^TM反应之后，一旦您观察到潮霉素耐受克隆，我们就推荐您将其挑选出来，并分析其中的目的基因表达情况。

Flp-In^TM Jurkat细胞的操作需要一些技巧，它们对离心操作非常敏感。你可以尝试使用以下方法来复苏细胞：

• 将1管细胞解冻至含有5-7 mL新鲜培养基的T25培养瓶中（没有抗生素）。此时请勿通过离心来去除DMSO，它们对于各种操作非常敏感（包括离心）。通常情况下，解冻后会出现大量碎片。
• 解冻后24小时之后，以900 rpm 2-3分钟的离心条件沉淀细胞，并使用5 mL新鲜培养基轻柔重悬细胞。将所有细胞整体离心会显著减少培养物中的碎片数量。
• 培养5或6天时即可加入筛选剂。在1.5周的时间内，按照2-3天的频率持续传代细胞（离心沉淀细胞），每一次都将细胞重悬至仅含5-7 ml新鲜培养基的T25培养瓶中，以重建细胞密度。Jurkat细胞非常细小和容易聚团，而且扩增得很慢。
• 仅在1.5周左右后，可以尝试将细胞传入T75培养瓶中进行扩增。