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我们致力于确保您的成功，让您的实验重回正轨。敬请浏览我们针对常见问题情境提供的专业建议。
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请查看以下可能原因：
我们强烈建议对阳性转化子进行测序，确认双链寡核苷酸插入片段的序列。在筛选转化子时，我们发现多达20%的克隆可能包含突变的插入片段（通常在双链寡核苷酸中有1或2 bp缺失）。其原因尚不清楚，但可能是由于双链寡核苷酸插入片段中的反向重复序列触发了E. coli的修复机制引起的。注意：双链寡核苷酸插入片段有突变的入门克隆，在哺乳细胞中RNAi效果通常较差。应确认入门克隆具有正确的双链寡核苷酸序列，并将这种克隆用于您的RNAi分析。
使用劣质的单链寡核苷酸也会导致出现突变的插入片段。为避免出现这类问题，可使用质谱分析法来检验质量错误的峰，或订购HPLC或PAGE纯化的寡核苷酸。
难以测序可能是因为发夹序列是一种反向重复序列，在测序期间可形成二级结构，从而导致在测序进行到发夹区域时出现信号跌落。如果您遇到测序困难的情况，请尝试以下建议：
你可尝试减少转染试剂的用量，或使用其他转染试剂。此外，应确保使用的质粒是纯净的，并为转染实验准备的。
有多种因素可导致敲低效果较差。请参见以下建议：
请访问我们的转染支持中心，查找关于转染的技术资源、贴士和技巧以及问题排查信息。
请确保您使用的含胎牛血清（FBS）的培养基已减少了四环素含量。许多FBS都含有四环素，因为FBS往往是从饮食中含四环素的牛体内分离出来的，这导致出现低水平的shRNA本底表达。应确保使用可表达Tet阻遏蛋白的细胞系，并以合适的MOI进行转导。如果您自行建立了可表达Tet阻遏蛋白的细胞系，则应在使用shRNA重组体转导细胞前至少等待24小时。
请查看以下可能原因：
如果使用重组的慢病毒，请查看以下其他可能性：
可以，只要您不使用可表达Tet阻遏蛋白的细胞系，则可实现组成型表达。
选用的shRNA可能无效。应确认shRNA序列不含有3个以上的串联胸腺嘧啶（T），否则会导致转录过早终止。您可尝试选择一个不同的目标区域。检测shRNA的发夹设计。应确保四环素用量正确。为诱导shRNA表达，应在转染后使用四环素处理细胞3-24小时。在诱导后24-96小时，检测目的基因的敲低。最后，请确认重组体被转导至可表达T-REx™阻遏蛋白的细胞中。（为建立可稳定表达Tet阻遏蛋白的细胞系，您可使用pcDNA™6/TR（用于pENTR™/H1/TO重组体）或pLenti6/TR（Lenti4/BLOCK-iT™-DEST重组体），并使用含杀稻瘟菌素的培养基维持细胞。）
请查看以下可能原因和解决方案：
筛选转化子时，使用了错误的抗生素 | 在含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上筛选转化子。 |
快速BP/LR反应可能对您的插入片段无效 | 使用标准BP和LR反应。 |
使用了蛋白酶K处理BP重组反应 | 在LR反应前，不要使用蛋白酶K处理BP反应。 |
未使用建议的Gateway BP和LR Clonase II Plus酶混合物，或Gateway BP和LR Clonase II Plus酶混合物失活 | 应将酶保存在-20°C或-80°C。酶的冻融次数不要超过10次。使用推荐剂量的酶混合物。另取一份分装的酶混合物进行活性测试。使用DEST载体对阳性对照入门克隆进行测试，确认LR Clonase II是否有活性。 |
用于转化的LR反应产物量不足 | 将2–3 µL的LR反应产物转化到One Shot Stbl3™化学感受态E. coli中。 |
转化后混合物铺板量不足 | 增加铺板量。 |
在将转化混合物铺板前，未执行1小时孵育生长步骤 | 在热休克步骤后，加入SOC培养基，并在铺板前将转化混合物置于37°C震荡孵育1小时。 |
在LR反应中，使用的BP反应物过多 | 在LR反应中，使用3 µL的BP反应产物。 |
在LR反应中，未使用pENTR™ 5’启动子载体 | 在LR反应中，您必须使用提供的pENTR™ 5’启动子载体（或使用您自己构建的含有您感兴趣的启动子的pENTR™ 5’载体）。 |
有些转化子所含质粒在5’和3’ LTR之间出现了不必要的重组。建议使用我们的One Shot Stbl3™化学感受态E. coli细胞，因为它们有助于稳定含正向重复序列的慢病毒DNA，通常可减少不必要的重组体。我们建议筛选两种大小的菌落；但是，通常情况下对慢病毒质粒，小菌落可能是正确的克隆。较大的菌落可能是由于发生过重组事件，删除了质粒的部分序列，从而使细胞的生长速度更快。
应确保所用的感受态细胞被正确保存于-80°C，在冰上融化并立即使用。加入DNA时，轻轻混合感受态细胞：不要使用移液管反复吹打混合。同时，转化所用DNA不要超过最大推荐用量（100 ng），或者DNA加入体积不要超过感受态细胞体积的10%，否则会抑制转化。
请查看以下可能原因和解决方案：
原因 | 解决方案 |
低转染效率
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使用不含丙酮酸钠的培养基培养转染细胞 | 转染后1天，弃去含DNA-脂质体混合物的培养基，然后加入含丙酮酸钠的全培养基。丙酮酸钠可为细胞提供额外的能量来源。 |
Lipofectamine 2000试剂的处理方法错误 | 保存在4°C；不可冷冻。使用前，轻轻颠倒混匀。不要涡旋。 |
过早收获病毒上清液 | 通常在转染后48–72小时收获病毒上清液。如果此时仍有很多细胞贴在培养皿上并且形态健康，则应等待24小时再收获病毒上清液。 |
病毒上清液太稀 | 使用任意一种可选方法浓缩病毒（Yee，1999）。 |
病毒上清液冻融多次 | 病毒上清液的冻融次数不可超过3次。 |
滴定用细胞选择不当 | 我们建议使用HT1080细胞。 |
目的基因对于细胞存活至关重要 | 通过使用含目标miRNA的入门重组体进行瞬时转染，确认目的基因不是细胞存活或生长所必需的。 |
滴定过程中未使用Polybrene试剂 | 将重组慢病毒转导至细胞时，应使用Polybrene试剂。 |
做一个杀死曲线，确定细胞株对抗生素的敏感性。应确保将病毒储液正确保存于-80°C，并且冻融次数不超过3次。最后，使用Polybrene试剂，将重组慢病毒转导至细胞。
请查看以下可能原因和解决方案：
原因 | 解决方案 |
低转染效率
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MOI过低 | 以更高的MOI将慢病毒重组体转导至细胞。 |
转导后，过早收获细胞和检测 | 应在转导后48-72小时收获细胞，使表达的miRNA在转导细胞中积累。如果在48小时观察到较低的敲低水平，则延长检测前的细胞培养时间，以完成基因敲低，或对细胞进行杀稻瘟菌素筛选。注意：对细胞进行杀稻瘟菌素筛选，可杀死未转导的细胞，从而改善基因敲低结果。 |
目的基因对于细胞存活很重要 | 应确保目的基因不是细胞存活或生长所必需的。 |
未滴定病毒储液 | 对慢病毒进行滴定。 |
病毒储液保存方法错误 | 分装并保存在-80°C；冻融次数不超过3次；如果保存时间超过6个月，应在使用前重新滴定。 |
选用的miR RNAi活性较低 | 选择一个不同的目标区域。使用miR RNAi表达重组体进行瞬时转染，以确定其敲低活性。然后进行慢病毒包装。请注意，一般来说，瞬时转染会使miR RNAi序列严重过表达，因此，当瞬转筛到的是中等活性的表达克隆时，后续包装成慢病毒后敲低活性可能更低。 |
病毒储液保存方法错误 | 分装并保存在-80°C。冻融次数不超过3次。 |
MOI过低 | 以更高的MOI将重组慢病毒转导至细胞。 |
有多种原因可导致细胞毒性作用。请查看以下可能原因和解决方案：
原因 | 解决方案 |
目的基因对于细胞存活至关重要 | 应确保目的基因不是细胞存活或生长所必需的。 |
使用了大体积的病毒上清液进行转导 | 弃去“营养耗尽”的含病毒培养基，加入新鲜的全培养基；浓缩病毒。 |
转导时使用了Polybrene试剂 | 确认细胞对Polybrene试剂的敏感性；如果细胞很敏感，则不要使用Polybrene。 |
使用过多的杀稻瘟菌素进行筛选 | 通过杀死曲线实验，确定您的细胞对杀稻瘟菌素的敏感性。使用杀死未转导细胞所需的最低杀稻瘟菌素浓度。 |
所用目标序列可能与其他基因具有较高的同源性；请选择一个不同的目标区域。
请使用推荐的滤波装置对所用荧光进行检测。使用倒置荧光显微镜进行分析。如有需要，可使蛋白表达持续1-3天，再进行荧光检测。
以下是可能原因和解决方案：
原因 | 解决方案 |
筛选转化子时，使用了错误的抗生素 | 在含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上筛选转化子。 |
未使用蛋白酶K处理LR重组反应 | 在转化前，使用蛋白酶K处理反应。 |
pAd/BLOCK-iT™-DEST质粒DNA被剪切 | 处理腺病毒目的载体时，应小心。不要进行可能会剪切DNA的多余操作（如，涡旋或用力吹打）。 |
未使用推荐用量的LR Clonase II酶混合物或LR Clonase II酶混合物失活 | -应将LR Clonase II酶混合物保存在-20°C。 -LR Clonase II酶混合物的冻融次数不可超过10次。 -使用推荐用量的LR Clonase II酶混合物（见使用手册第14页）。 -另取一份分装的LR Clonase II酶混合物进行活性测试。 |
用于转化的LR反应产物不足 | 将2–3 µL的LR反应物转化到合适的感受态E. coli菌株中。使用转化效率>1 x 108 cfu/μg的E. coli细胞。 |
转化混合物铺板量不足 | 增加E. coli铺板量。 |
LR反应使用了过多的入门克隆DNA | 在LR反应中，使用50–150 ng的入门克隆。 |
以下是可能原因和解决方案：
原因 | 解决方案 |
将LR反应产物转化到了含F’游离体和ccdA基因的E. coli菌株中 | 使用不含F’游离体的E. coli菌株进行转化（如，TOP10和DH5α-T1R）。 |
pAd/BLOCK-iT™-DEST载体中的ccdB基因缺失（全部或部分） | 腺病毒DEST载体是以溶液形式提供的，可立即用于LR反应。但是，如果您想对其进行扩增： propagate them: -使用含100 μg/mL氨苄青霉素和15–30 μg/mL氯霉素的培养基筛选转化子，从而维持载体的完整性。 -从一个或多个菌落中提取质粒DNA，使用前应确认载体的完整性。 |
以下是可能原因和解决方案：
原因 | 解决方案 |
低转染效率 -pAd/BLOCK-iT™-DEST表达克隆质粒DNA被剪切 -PacI消化不完整或经消化的DNA被苯酚、乙醇或盐污染 -293A细胞不健康；细胞存活率较低 -转染前一天，293A细胞接种过于稀疏 -质粒DNA与转染试剂的比例不正确 |
-处理质粒DNA时，应小心。不要进行可能会剪切DNA的多余操作（如，涡旋或用力吹打）。 -重复PacI消化。应确保纯化的DNA未被苯酚、乙醇或盐污染。 -使用健康的293A细胞；细胞不可过度生长。 -转染时，细胞应达到90–95%汇合度。 -优化转染条件，使质粒DNA（µg）与Lipofectamine 2000（µL）的比例在1:2至1:3之间。如果您在使用其他转染试剂，则应根据生产商的建议进行优化。 |
病毒上清液太稀 | 使用氯化铯纯化法或任意一种可选方法浓缩病毒。 |
病毒上清液冻融多次 | 病毒上清液的冻融次数不可超过10次。 |
以下是可能原因和解决方案：
原因 | 解决方案 |
病毒储液保存方法错误 | 分装并保存在-80°C。冻融次数不可超过10次。 |
滴定所用的细胞错误 | 使用293A细胞或任何具有使用手册第23页所述特性的细胞。 |
覆层琼脂糖准备不当 | 琼脂糖在加到细胞前不可过热；热的琼脂糖会杀死细胞。 |
这可能是因为对病毒上清液稀释不足。我们建议先10倍连续稀释病毒储液（范围为10–4至10–9）再对腺病毒储液进行滴定。
以下是可能原因和解决方案：
原因 | 解决方案 |
病毒储液保存方法错误 | 分装并保存在-80°C。冻融次数不可超过10次。 |
目的基因含有PacI位点 | 通过诱导突变而改变或除去PacI位点。 |
选用的shRNA无活性 | 选择一个不同的目标区域。如果可能，应先通过瞬时转染筛选shRNA。 |
MOI过低 | 以更高的MOI将重组腺病毒转导至细胞。 |
以下是可能原因和解决方案：
原因 | 解决方案 |
转导效率低： -哺乳细胞不健康 -使用了非分裂细胞 |
-转导前，应确保细胞是健康的。 -以更高的MOI将腺病毒重组体转导至细胞。 |
MOI过低 | -以更高的MOI将腺病毒重组体转导至细胞。 |
病毒滴度较低 | 采用使用手册第27页的操作步骤，扩增腺病毒储液。 |
选用的shRNA活性较低 | 选择一个不同的目标区域。如果可能，应先通过瞬时转染筛选shRNA。 |
腺病毒储液被RCA（可复制的腺病毒）污染 | -筛查RCA污染。 -制备新的腺病毒储液或通过空斑纯化法分离重组腺病毒。 |
转导后，过早收获细胞 | 应在转导后48-72小时收获细胞，使表达的shRNA在转导细胞中积累。 |
转导后，过晚收获细胞 | 对于活跃的分裂细胞，在转导后5天内可检测到重组蛋白的最高表达水平。 |
敲低目的基因导致细胞死亡 | 应确保您的目的基因不是细胞存活或生长所必需的。 |
以下是可能原因和解决方案：
原因 | 解决方案 |
使用了过多的粗制病毒储液 | -转导时减少粗制病毒储液的用量或稀释粗制病毒储液。 -扩增腺病毒储液。 -浓缩粗制病毒储液。 |
野生型RCA（可复制的腺病毒）污染 | 筛查RCA污染。通过空斑纯化法分离重组腺病毒，或制备新的腺病毒储液。 |
仅限研究用途，不可用于诊断操作。