SuperScript™ III 反转录酶

如果在不含反转录酶的对照管/孔中生成扩增产物，必须从RNA样品中去除残留的基因组DNA。您可通过下述实验方案从总RNA中去除基因组DNA。

在冰上，将以下成分添加到无菌的 0.5 mL微量离心管中：
1.总RNA，最好小于或等于1 μg。（见下文注1。）
2.1.0 μL的10 X DNase缓冲液 (200 mM Tris, pH 8.3, 500 mM KCl, 20 mM MgCl2)。
3.0.1 U–3.0 U的DNase I（无RNase，货号18047019）或1.0 U的扩增级Dnase I,（货号18068015。参见下文注2。）
4.加入DEPC处理的水，将总体积加至10 μL。
5.在室温下孵育15分钟。（参见下文注3。）
6.加入1 μL 25 mM EDTA终止反应，并在65°C下加热10分钟。（参见下文注4。）
7.置于冰上1分钟。
8.通过短暂的离心处理进行回收。这样产生的混合物可直接用于反转录反应。

请留意以下注意事项：
1.如需处理更多的RNA，可线性放大整个反应体系。在10 μL的反应体系中，RNA不要超过2 μg。加入的RNA过多会导致溶液粘度增加，从而抑制DNase I扩散并找到DNA。
2.扩增级DNase I已经过充分纯化，去除了其他所谓的“RNase-free”酶制备过程后仍然残留的痕量核糖核酸酶的活性，不需要添加RNase抑制剂。
3.务必保证孵育时间不超过15分钟、温度不高于室温。温度过高或者孵育时间过长会导致RNA出现Mg2+依赖性水解。
4.这一步骤需要小心地吸取所有溶液，以确保二价的金属阳离子(Mg2+)的浓度能够得到有效控制。
5.由于DNase I必须加热到65°C来灭活酶，在加入EDAT之后，必须保证游离的二价金属离子浓度足够低（少于1 mM），以免RNA出现化学水解。另请参见下文的参考文献。

在加入EDTA后， Mg2+:EDTA的摩尔比例约为1:1。EDTA会与Mg2+分子按照1:1的摩尔比例进行螯合。因此，该RNA可直接被用于下游的反转录反应。加入第一链反转录酶缓冲液会使镁离子的终浓度为2.5mM。如果反转录反应缓冲液中不含MgCl2，则可向反应系统中添加MgCl2直至其终浓度达到2.5 mM。这样MgCl2的净终浓度约为2.25-2.5 mM。

RNA水解参考文献：
Molekulyarnaya Biologiya (1987) 21:1235-1241.
References on the mechanism of hydrolysis by other cations:
Eichorn GL and Butzov JY (1965) Biopolymers 3:79.
Butzov JY and Eichorn GL (1965) Biopolymers 3:95.
Farkas WR (1968) Biochim Biophys Acta 155:401.
第一篇论文的作者表达了这样一种观点，即由于阳离子引起的非特异性水解（通过2'，3' 磷酸环化进行）类似于RNA剪接时发生的特异性水解。

cDNA合成所需的RNA模板量具有高度的灵活性，取决于可用的样品量和个人需求。通常情况下，1 μg总RNA可进行一次常规20-μL反转录反应。

有些人觉得，反转录之后形成的RNA:DNA双链之中的RNA会抑制PCR引物退火和扩增cDNA。使用RNase H-的突变体反转录酶时，RNA仍然存在。RNase H可以去除与cDNA结合的RNA。但另一方面，有些人认为95°C的变性步骤会造成RNA引物与DNA脱离，因而RNase H处理完全没有必要。因此这一步骤是可选的。在克隆较大的片段时，RNase H处理的做法较为有益。

这很大程度上依赖于样品的质量。mRNA占总RNA的1–5%。根据所用的引物和酶，反转录反应可以将>70%的RNA转换成cDNA。

对于降解的RNA、含有严重的二级结构的RNA、无polyA尾的RNA或原核RNA，随机引物是最佳选择。随机引物仅推荐用于两步法RT-PCR，而且通常可以获得最高的得率，尽管cDNA可能不为全长cDNA。如希望通过两步法RT-PCR得到全长cDNA时，最好使用Oligo(dT)引物。这一反应受到二级结构和RNA质量影响。基因特异性引物应用于特异性基因的扩增反应，主要用于一步法RT-PCR反应。