TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ 试剂盒

Ambion™ TaqMan PreAmp Cells-to-C_T 试剂盒实现直接从有限或少量培养细胞中进行基因表达分析，而无需 RNA 纯化。该方案包括逆转录与实时荧光定量 PCR 之间的中间扩增步骤（预扩增），其间可针对多达 100 个用户选择的基因靶标富集 cDNA，无扩增偏倚。

•完整、经验证的解决方案—优化的工作流程包括细胞裂解试剂、DNase、RT 试剂、PreAmp 试剂和 TaqMan™ 基因表达预混液
• 快速、简单和便捷—样品制备仅需 7 分钟；无需繁琐的 RNA 分离
• 扩展有限的样品— 将实时荧光定量 PCR 潜力提高多达 64 倍；可同时研究多达 100 个基因
• 结果精确—均一扩增，不引入偏差
• 稳健性能—为 10 至 100,000 个细胞进行线性化检测；结果相当于纯化的 RNA

完整、经验证的解决方案

TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ 试剂盒采用独特的方法裂解培养细胞，同时去除基因组 DNA 并保持 RNA 完整性，含有用于 cDNA 合成的逆转录 (RT) 试剂、用于预扩增多达 100 个基因靶标的 TaqMan™ PreAmp 预混液和用于实时荧光定量 PCR 分析的 TaqMan™ 基因表达预混液。

简单、便利的 7 分钟样品制备

TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ 试剂盒包含简单的 7 分钟样品制备程序（图 1），可与 10–100,000 个培养细胞⁄样品配合使用。细胞先用 PBS 清洗，再于室温下置于裂解液中裂解 5 分钟；同时进行 DNase 处理。裂解过程在加入终止液，室温孵育2分钟后被终止。

裂解物现在可以在 –20°C 条件下进行逆转录或储存。由于样本直接在培养板上（96 或 384 孔）处理，样本处理、样本丢失或转移错误可能性被降至较低水平，有利于扩展有限样品。无需加热、清洗或离心；该试剂盒极大地简化了传统上耗时的劳动密集型过程，并将时间减少至 7 分钟。

扩展有限的样品—将实时荧光定量 PCR 潜力提高多达 64 倍

Cells-to-C_T™ 技术与预扩增能力的集成简化了多步骤工作流程，同时显著提高（大于 60 倍）了使用珍贵样品可进行的 PCR 反应次数，并提高了使用少量样品起始量检测 mRNA 的灵敏度。

用于基因表达分析的标准实时荧光定量 PCR 反应首先使用随机引物和 Oligo dT 将总 RNA 逆转录为 cDNA，然后使用基因特异性引物和探针进行实时荧光定量 PCR 反应（图 2）。使用 TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ 试剂盒，进行逆转录与实时荧光定量 PCR 之间的中间扩增步骤（预扩增），其间可针对多达 100 个用户选择的基因靶标富集 cDNA，无扩增偏倚。稀释所得预扩增反应，并使用试剂盒中包含的 TaqMan™ 基因表达预混液作为后续单个 TaqMan™ 基因表达检测的起始材料。TaqMan™ PreAmp 工艺有效地将样品扩展达 64 倍，从而能够进行先前通过有限的样品材料无法进行的分析。

结果精确—可在不引入偏倚的情况下进行同等扩增

能够进行可靠和均一的预扩增，这对于通过有限样品进行的基因表达分析至关重要。尽管也可采用其他方法预扩增 RNA 或 cDNA，这些方法使用非特异性引发扩增起始材料，导致部分转录本与其他转录本之间存在扩增偏差和失准。TaqMan™ PreAmp 预混液随附在 TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ 试剂盒之中，利用基因特异性引物预扩增 cDNA，确保无偏扩增。与100种不同的 TaqMan 基因表达测定试剂比较时，TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ 试剂盒均展现出与纯化 RNA 相当的无偏预扩增。如图3所示，预扩增反应不会因 Cells-to-C_T™ 裂解物或纯化样品引入偏差；无论源自纯化 RNA (A) 还是 Cells-to-C_T™ 试剂盒裂解物 (B) 的预扩增和未扩增的 cDNA，≥ 92% 的测定的 CT 值均在 +⁄- 1.5 ΔΔ 范围内。

稳健的性能 — 结果与纯化 RNA 相当
TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ 试剂盒的性能已经采用100种不同的 TaqMan™ 测定试剂、利用 Cells-to-C_T™ 裂解物或纯化 RNA 分别在预扩增/未预扩增条件下进行了测试。如图4所示，TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ 试剂盒裂解物获得的 CT 值等于（通常优于）纯化 RNA—无论是在预扩增前 (A) 还是预扩增后 (B)。高性能的 TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ 试剂盒裂解物可帮助保存起始样品中的 RNA，避免因加热、转移或基质吸附造成损失。

10至100,000个细胞的线性检测

RNA 图谱分析工作流程每一步骤都必须稳健，能够同时分析少量或多个细胞。TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ 试剂盒经过优化，可在5个数量级的细胞上样量下有效生成 10–100,000 个细胞/裂解反应的线性结果（图5）。此外，为尽可能提高灵敏度，TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ 试剂盒允许至多 45% 的逆转录反应体积由样品裂解物组成。在实时荧光定量 PCR 分析前，TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ 试剂盒通过逆转录反应使用的大裂解物体积，优化的逆转录反应条件和样品预扩增来达到极佳灵敏度。

久经验证的性能、成熟的组合

TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ 试剂盒的所有成分均经过充分优化，可实现稳定可靠的性能。这有助于避免因组合单独的样品制备、逆转录、预扩增和实时荧光定量 PCR 试剂盒而引入的不确定因素。为进一步提高质量保障，TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ 试剂盒采用 TaqMan™ 基因表达测定进行了验证。