说明:
Sequenase™ 版本 2.0 DNA 聚合酶是基因工程改造形式的 T7 DNA 聚合酶。与野生型酶不同,它几乎没有 3'→5' 核酸外切酶活性。Sequenase 版本 2.0 具有高度持续性,包含核苷类似物(dlTP、硫代-dNTP、双脱氧-NTP 等),不会受阻于二级结构,并可进行链置换合成。该酶可出色用于双脱氧测序,在其他应用中也很有帮助,尤其适合不存在相关核酸外切酶活性的情况。
Sequenase 版本 2.0 有两个亚单元,一个是大肠杆菌硫氧还蛋白 (MW 12,000),另一个是噬菌体 T7 基因 5 蛋白 (MW 76,000) 的基因工程改造版本。该亚单元发生的基因改变(通过体外突变删除 28 个氨基酸)清除了所有可测量的核酸外切酶活性,但不会改变 DNA 聚合酶的活性。
特性:
分子量:包括两个亚单元,经修饰的 T7 基因 5 蛋白 (76 kDa) 和大肠杆菌
硫氧还蛋白 (12 kDa)
极佳 pH 值:7.5
极佳温度:37°C
二价阳离子要求:Mg2+、Mn2+
纯度:
通过 SDS-PAGE 测得纯度大于 95%。针对污染性双链和单链核酸内切酶和核酸外切酶进行了检测。
储存缓冲液:
20 mM 磷酸钾(pH 值 7.4)、1 mM DTT、0.1 mM EDTA、50% 甘油。
检测条件:
反应混合物 (100 µL) 包含 40 mM Tris-HCl(pH 值 7.5)、10 mM MgCl2、5 mM DTT、0.3 mM dNTP 和 5 µg M13mp18(预退火至 5 pmol M13 通用型引物)。将酶添加至预热 (37°C) 的反应混合物中;37°C 下孵育 1 分钟。
单位定义:
一个单位的酶可在 37°C 下于 30 秒内催化 1 nmol 核苷酸至不溶性酸的掺入过程。
浓度:
13 个单位/µL
功能检测:
使用 Sequenase 版本 2.0 DNA 测序试剂盒 (PN 70770) 进行 DNA 测序
经功能检测的 5X Sequenase 反应缓冲液(随附 1 mL,PN 70702):
200 mM Tris-HCl(pH 值 7.5)、100 mM MgCl2、250 mM NaCl
Sequenase 稀释缓冲液(随附 1 mL,PN 70765):
10 mM Tris-HCl(pH 值 7.5)、5 mM DTT、0.1 mM EDTA。
参考文献:
Tabor, S. and Richardson, C. C. (1989) J. Biol.Chem.264, 6447-6458.
Wang, D., Coscoy, L., Zylberberg, M., Avila, P. C., Boushey, H. A., Ganem, D. and DeRisi, J. L. (2002) Proc Natl.Acad.Sci.USA, 99, 15687-15692.
Paris, M. (1992) Comments 18, (No. 3), United States Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio.
Tabor, S. and Richardson, C. C. (1987) Proc.Natl.Acad Sci.USA84, 4767-4771.
Tabor, S. and Richardson, C. C. (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA86, 4076-4080.
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.