GeneArt™ CRISPR 核酸酶 mRNA 采用新型制造工艺配制而成，具有出色的质量和更优的产品性能。这种野生型 Cas9 mRNA 具有两种细胞核定位信号 (NLS)。经证明，具备两种 NLS 的 Cas9 构建体能更有效地将 Cas9 蛋白靶向至细胞核 (1)。在使用 CRISPR 载体体系时，mRNA 结构随时均可进行转染并能避免必需的耗时克隆步骤。Cas9 mRNA 与靶标特异性向导 RNA (gRNA) 进行共转染可以将 Cas9 蛋白指向至预期的基因组位点，从而形成双链断裂。相较基于质粒的 Cas9 系统而言，完整 RNA 结构的有效载荷更小，这既可以优化向细胞内部进行的传递，还能获得更好的基因组编辑效率。此外，Cas9 mRNA 还可用于具有多种 gRNA 的多通路方法。利用这种方法可以确定哪种 gRNA 序列最适合特定靶标，或者还能通过一次转染对多个基因组位点进行编辑。

如何获取 gDNA 序列
利用 CRISPR 技术进行基因组编辑时需要使用非编码的向导 RNA (gRNA)，以便在目标靶序列上剪切基因组 DNA。gRNA 具有两个分子组件：一条靶向型 CRISPR RNA (crRNA) 和一条反式激活 crRNA (tracrRNA)，其中 crRNA (tracrRNA) 已经结合到了一个转录本中。靶序列（20个碱基）必须立即位于允许 Cas9 启动结合的 PAM 基序 (NGG) 上游。PAM 仅位于靶 DNA 上且并非靶标特定 CRISPR 序列的一部分。gRNA 和 PAM 基序引导 Cas9 核酸酶与靶向基因组序列形成复合物，并从 PAM 位点上游形成平端 DNA 双链断裂 (DSB) 的三个核苷酸。

使用我们的 GeneArt CRISPR 搜索和设计工具即可在我们的数据库中搜索人和小鼠基因组中各基因专有的600,000多种 gRNA 序列。GeneArt 预设计的 gRNA 针对基因敲除进行了优化，且通常能以每个基因的前三个转录外显子为靶标。搜索结果包括基于将潜在脱靶效应降至最低、潜在结合位点以及 gRNA 位置外显子图谱的建议。此工具也可用于分析任意目标序列以设计出独特的 CRISPR 序列。

如何构建 gRNA
选择 gRNA 序列之后，请从三种构建 gRNA 的方案中进行选择：
1.GeneArt Precision gRNA 合成试剂盒在短短四小时内即可构建出可直接转染的 gRNA（包括模板组装）。
2.GeneArt CRISPR Strings 是一种合成 DNA 模板，它由 gRNA 与用于体外转录的 T7 启动子或用于即用型转染结构的 U6 启动子组成，可通过 GeneArt CRISPR 搜索和设计工具或填写 GeneArt CRISPR Strings DNA 订货单并将此订货单发至 GeneArtSupport@lifetech.com 进行购买。
3.省时省力，我们的 GeneArt 定制服务团队将为您设计、合成并纯化体外转录 (IVT) gRNA 序列。如需获取服务报价或进行订购，请联系我们的定制服务部门，电话：1-800-955-6288 转 45682，邮箱：custom.services@lifetech.com。

资源
演示实验方案：使用 CRISPR-Cas9 改造干细胞基因

参考文献
1.Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F. (2013) Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.Science 339(6121):819-23.