mMESSAGE mMACHINE™ T7 转录试剂盒

mMESSAGE mMACHINE™ 试剂盒设计用于体外合成大量的加帽 RNA。加帽 RNA 可模拟体内发现的大多数真核 mRNA，因为其在 5' 末端有一个 7-甲基鸟苷帽结构。mMESSAGE mMACHINE™ 试剂盒反应包括超高得率转录反应中的帽类似物 [m⁷G(5')ppp(5')G]。帽类似物仅作为转录本的第一个或 5' 末端 G 掺入，因为其结构使得无法在 RNA 分子中的其他位点将其掺入。

mMESSAGE mMACHINE™ 试剂盒工作原理
mMESSAGE mMACHINE™ 试剂盒有简化的反应形式，其中所有 4 种核糖核苷酸和帽类似物混合于单一溶液中。该溶液的帽类似物:GTP 比值为 4:1，这适用于尽可能提高 RNA 得率和加帽转录本比例。mMESSAGE mMACHINE™ 试剂盒适用于卵母细胞显微注射用加帽 RNA 常规合成、体外翻译、转染和其他应用。在存在高核苷酸浓度的情况下，通过优化 RNA 合成的反应条件来实现高得率。此外，合成的 RNA 不会被任何可能含有 RNase 抑制剂（酶混合物的组成部分）的污染性核糖核酸酶降解。

使用 mMESSAGE mMACHINE™ 试剂盒
在 20 µL 反应中，在 2 小时孵育期间，mMESSAGE mMACHINE™ 高得率加帽 RNA 转录将生成大量的加帽 RNA。该方法获得的得率为使用常规体外转录反应的 10–50 倍。帽类似物与 GTP 的比值已经过优化，能够在得率 (15–35 µg) 与加帽转录本的比例 (80%) 之间实现良好折衷。mMESSAGE mMACHINE™ 试剂盒还包含一份 LiCl 沉淀溶液，该溶液可高效分离来自加帽 RNA 的蛋白和未掺入的核苷酸（包括游离帽类似物），提高翻译效率。mMESSAGE mMACHINE™ 试剂盒仅针对与试剂盒中包含的聚合酶配合使用进行了优化。使用不同的聚合酶可能会导致得率低。mMESSAGE mMACHINE™ 试剂盒包含 25 次转录反应所需的所有缓冲液和试剂。使用试剂盒提供的对照模板（非洲蟾蜍延伸因子 1α，pTRI Xef），每次 mMESSAGE mMACHINE™ 反应将使用 T3 或 T7 RNA 聚合酶生成约 20–30 µg 的 RNA，或使用 SP6 RNA 聚合酶生成约 15–25 µg RNA。