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含 EmGFP 的 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒
Invitrogen™
含 EmGFP 的 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒
货号:
K493600
相关应用:
Gateway Cloning
RNAi
技术支持
客户服务
Invitrogen™
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含 EmGFP 的 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒兼具了传统 RNAi 载体的优势(稳定表达和使用病毒递送的能力)与组织特异性表达和同一转录本中多次靶标基因敲低能力。包括在含 EmGFP 的 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒中的 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR 载体设计用于表达人工 miRNA,其经基因工程改造后与靶序列具有 100% 同源性,将导致靶标切割。该载体包括来自内源性 miRNA 的侧翼和环序列,其指导从较长的 Pol II 转录本(miRNA 前体)中切除基因工程改造 miRNA。使用 Invitrogen 优质 BLOCK-iT™ RNAi Designer,70% 以上的构建体产生超过 70% 的敲低。基因工程改造 miRNA 的 Pol II 表达可实现:
o CMV 立即早期启动子的强表达,可选择通过 MultiSite Gateway™ 重组使用组织特异性或其他调节启动子
o pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR 载体中祖母绿 GFP (EmGFP) 报告基因的同-顺反子表达,使 EmGFP 的表达与目的 miRNA 敲低活性之间具有极强的相关性
o 与许多用于基因表达的 Invitrogen Gateway™ 目的 (DEST) 载体兼容;包括用于稳定转导分裂、非分裂和原代细胞类型的慢病毒载体、用于单位点染色体整合的 Flp-In™ 系统以及替代报告基因融合构建体
o 在同一转录本上表达一个以上的基因工程改造 miRNA,允许同时敲低多个基因并产生合成表型
工作原理
对于 miR RNAi 序列的高水平表达,pcDNA™6.2-GW/miR 载体包括 CMV 启动子(图1)。只需在免费的在线 BLOCK-iT™ RNAi Designer 中输入 RefSeq 登录号或核苷酸序列,该软件即可设计出与目标靶标具有 100% 同源性的优化 miRNA。使用快速连接方案将 miRNA 克隆至载体中并进行转染,以立即表达 miRNA。表达的 miRNA 在细胞核中通过内源性细胞机制(包括 Drosha)加工,然后转运至细胞质中,在细胞质中通过 Dicer 进行进一步加工(图2)。然后将完全加工的 miRNA 掺入 RISC 中,在后者中其功能类似于 siRNA,并可导致 mRNA 靶标切割。
对于多种表达选项,miRNA 盒(含有 EmGFP、miR 侧翼区和与目标靶标同源的 miRNA)可轻松地转移至多种 DEST 载体中。这通过 Gateway™ 重组反应发生,在该反应中,将 miRNA 盒转移至 pDONR™ 载体中(BP 反应),然后转移至首选 DEST 载体中(LR 反应)。
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
规格
产品类型
RNAi 表达载体试剂盒
基因
GFP (EmGFP)
克隆方法
Gateway™
构成或诱导系统
组成型
输送类型
转染
RNAi 类型
miRNA
选择试剂(真核生物)
杀稻瘟菌素
载体
BLOCK-iT RNAi 载体
促进剂
CMV
产品规格
试剂盒
产品线
BLOCK-iT™、Gateway™
数量
20 次反应
内容与储存
BLOCK-iT™Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒含有两个盒。克隆盒含有线性化 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR、10X 退火缓冲液、T4 DNA 连接酶、5X DNA 连接缓冲液、lacZ 对照寡核苷酸、lacZ 对照质粒、阴性对照质粒、无 DNase/RNase 水以及正向和反向测序引物。将载体、缓冲液、对照寡核苷酸和质粒、水和测序引物储存在 -20°C 下。One Shot™ 盒含有转化试剂,包括 21 份 50 µL One Shot™ TOP10 化学感受态大肠杆菌、S.O.C. 培养基和 pUC19 超螺旋对照质粒的等份试液。将这些转化试剂储存在 -80°C 下。妥善储存时,所有试剂均可保证稳定储存 6 个月。
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