注1.2 — 荧光共振能量转移技术 (FRET)

荧光共振能量转移 (FRET) 是两种染料分子电子激发状态之间的距离依赖性相互作用，在该状态下，激发将从供体分子转移至受体分子，而 不发射光子。FRET 的效率取决于分子间分离的反向六分之一， 这使得其在与生物大分子的尺寸相当的距离上也能发挥作用。因此，FRET 是一种重要的技术，用于研究产生分子接近变化的各种生物学现象。 当 FRET 用作对比机制时，可以采用超出常规光学显微镜极限的空间分辨率对蛋白质和其他分子进行共定位成像。

• 供体和受体分子必须靠近（通常为 10–100 Å)。
• 受体的吸收光谱必须与供体的荧光发射光谱重叠（图 1）。
• 供体和受体过渡偶极方向必须大致平行。

图1.FRET 光谱重叠积分的示意图。

能量传输效率达到 50% 的距离 (即 50% 的激发供体经 FRET 失活) 由 Förster radius(R₀) 定义。R₀的大小取决于供体和受体染料的光谱特性（表 1）：

表 1.R₀的典型值

在大多数应用中，供体和受体染料不同，在这种情况下，可通过受体敏化荧光的外观或供体荧光淬灭来检测 FRET。当供体和受体相同时，可以通过产生的荧光去极化来检测 FRET。 一些染料对的 R₀ 典型值见 表 1，更广泛的编译见 一些 Invitrogen ™ Alexa Fluor ™染料的 R<0> 值—表 1.6 和 QSY 和 dabcyl 淬灭剂的 R<0> 值—表 1.11。请注意，由于 R₀ （见上文）的组分因子取决于环境，因此在特定实验情况下观察到的实际值有些变化。在文献中可以找到 R₀ 值的大量编译。 Dabcyl 和 QSY 染料等非荧光受体（分子探针非荧光淬灭剂和光敏剂—表 1.10）具有消除直接（即未致敏）受体激发产生的背景荧光的潜在问题的独特优势。 已经计算了从几种供体染料至分子信号杂交探针 QSY 7 淬灭剂的 FRET 效率。 我们开发的包含荧光供体-非荧光受体组合的探针，主要用于检测蛋白水解 （图 2）和核酸杂交。

图2.HIV 蛋白酶底物 1 (H2930) 对蛋白酶切割的荧光反应原理。在间距肽连接子切割后，通过距离依赖性共振能量转移至 dabcyl 淬灭剂 (Q) 消除了 EDANS 荧光基团 (F) 淬灭。

• 蛋白质的结构和构象
• 蛋白质复合物的空间分布和组装
• 受体/配体相互作用
• 免疫检测
• 探测单个分子的相互作用
• 核酸的结构和构象
• 实时 PCR 检测和 SNP 检测
• 核酸杂交检测
• 检测突变的引物延伸试验
• 自动化 DNA 测序
• 脂质的分布和运输
• 膜融合分析 （膜融合的脂质混合试验—注 13.1）
• 膜电位传感
• 荧光蛋白酶底物
• 环磷酸腺苷 (AMP) 和钙指示剂