Qubit 荧光定量系统样本数据

DNA 定量数据

准确度和精确度

Qubit 荧光计的准确度和精确度。准确度可通过使用 Qubit dsDNA HS 检测确定相对真实浓度的平均偏差而评价，而精确度可使用 Qubit dsDNA BR 检测确定各浓度下重复的变异系数 (CV) 而确定。低偏差百分比证明了 Qubit Flex 和 Qubit 4 荧光计的准确度，而低 CV 百分比则证明了其精确度，特别是对 Qubit Flex 型号来说。在所测试的三台仪器中，其他品牌仪器的准确度和精确度较低。

准确度和灵敏度

准确性和灵敏度：Qubit dsDNA 与紫外吸光度法的比较在 Qubit 荧光计上用 Qubit dsDNA HS 检测试剂盒按标准试剂盒方案对已知浓度范围在 0.01-10 ng/μL 的 λ DNA 样本进行了10次的重复实验（蓝色条显示）。在10次的重复实验中，用微体积分光光度计并采用紫外吸光度法测量相同浓度范围的 DNA （红色条），并比较检测结果的准确度和精度。每一色条代表 10 个重复实验的平均值，而误差线（Qubit 的测量值几乎不可见）代表其标准差。x 轴刻度代表在 Qubit 检测管中稀释前起始样品中已知的 DNA 浓度，而 y 轴刻度代表测得的浓度。Qubit 荧光计的测量值比紫外吸光度法更准确 (y » x)、灵敏（低浓度，见插图）和精准（更短的误差线）。

灵敏度和选择性

Qubit dsDNA HS 检测试剂盒的灵敏度和选择性

Qubit dsDNA HS 检测可为已知递增数量的 dsDNA （绿色圆圈）回报准确、线性的结果，即使是在较低含量下亦是如此（插图，放大了比例尺的最低端）。这些特异于 DNA 的测量仅受到单独添加 RNA（红色三角形）或与 DNA 结合（蓝色方块）的 RNA 略微影响。

A) Qubit 1X dsDNA HS 检测

B) Qubit 1X dsDNA BR 检测

Qubit 1X (A) dsDNA HS 和 (B) BR 检测的选择性

图显示了用已知数量的 DNA 和 RNA 接种的样本的定量结果与预期值的对比。圆圈代表含有 10 μL DNA 加 190 μ L 的工作溶液样品，浓度各不相同。方块代表含有 10 μL RNA、10 μL DNA 加 180 μ L 的工作溶液样品，浓度各不相同。圆圈和方块距离很近，有些情况下甚至几乎无法区分，表明这两种 dsDNA 检测不太受 RNA 的影响。

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RNA 定量数据

准确度和选择性

Quantification measurements taken of RNA and siRNA with Qubit RNA and microRNA assay kits show strong specificity and sensitivity to each type of molecule in comparison to UV absorbance measurement.

Qubit RNA and microRNA assays

Qubit RNA 和 microRNA 检测的准确度和选择性。 将 x 轴上所列浓度的核糖体 RNA (rRNA) 添加到含有 2 μg/mL siRNA 的样品中。然后使用 Qubit microRNA 检测、Qubit RNA 检测和通过紫外吸光度定量的 NanoDrop A260 检测对混合物进行检测。显示8个重复次数的结果平均值和标准差。NanoDrop 仪器（紫色条）的总 RNA 浓度检测限是 1.5 μg/mL，影响了其较低浓度下的准确度和精度。Qubit RNA 检测试剂盒（红色条）在较大范围内准确定量了 rRNA 浓度。Qubit microRNA 检测试剂盒（蓝色条）准确定量了 2 μg/mL 的 siRNA 浓度，而当 rRNA 从该量增加2到5倍时，准确性受到轻微影响。蓝色和红色趋势线分别指示了样本中的 siRNA 和 rRNA 的实际浓度。

准确度、精度和灵敏度

Qubit microRNA 检测的准确度、精度和灵敏度。共进行了六次使用纯 siRNA 的实验以测试 Qubit microRNA 检测的准确度和精度；典型实验结果如图所示。本试验中，使用 Qubit microRNA 检测与 Qubit 荧光计以及 NanoDrop ND-1000 分光光度计的 A₂₆₀ 波长下测定已知浓度 0.1-12 μg/mL 的 GAPDH siRNA 的8个重复样本。NanoDrop 仪器的检测限是 1.5 μg/mL；此处显示较低的 siRNA 浓度结果以便比较。Qubit microRNA 检测的准确度在预期的 15% 内。CVS（1 个标准差/8个数据点的平均值）为 0.63-2.9 %。在所有六个实验中，Qubit microRNA 检测的准确度均在预期的 15% 内，且 CV 为 <5%。

准确度和广度

Qubit microRNA 检测的准确度和广度。纯 siRNA 和 miRNA 样品的浓度由 PerkinElmer® 分光光度计 0.3–0.6 A₂₆₀ 下浓度的光学密度而确定。然后稀释样本，并使用 Qubit microRNA 检测测试四个已知浓度。结果表明(A) 四个不同的单链 siRNA 分子以及 (B) 两个双链 siRNA 分子和两个双链 miRNA 分子均准确定量。

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RNA 完整性和质量 (IQ) 数据

选择性和有效性

适用于大小 RNA 分子的 RNA IQ 检测试剂的选择性。在 Qubit 4 荧光计上使用 Qubit RNA IQ 检测分析含 100 ng/µL rRNA（大肠杆菌）和不同浓度 (0–50 ng/µL) siRNA 的 3 个重复样本。显示这些样本的 (A) 相对荧光单位 (RFU) 和 (B) IQ 评分的图。数据表明，染料分别特异于大 RNA（如 rRNA）和小 RNA（如 siRNA）分子，且 IQ 评分与样本中大 RNA 分子的百分比密切相关。

由 Qubit RNA IQ 检测测量的 RNase A 对 rRNA 降解的时间趋势。将 100 ng/µL rRNA 溶液的 3 个重复样本与不同数量的 RNase A 在含多个染料和检测缓冲液的最终检测溶液中一起培养。(A) RNA IQ 评分反映出高量 RNase A 会在 60 分钟内加速 RNA 的降解。(B) 暴露于 10 FM RNase A 下会导致一小时内大 RNA 分子的荧光逐渐下降，而小 RNA 分子的荧光会相应增加。(C) 在 100 FM RNase A 下，这些变化的速度更快。

RT-qPCR 验证

RNA IQ 与 RT-qPCR 结果一致，而 Bioanalyzer™ RNA 完整性数 (RIN) 则不是。总 RNA（分离自人肝脏）在 75°C 条件下加热处理不同期间后，使用 Agilent™ Bioanalyzer™ 系统和 Qubit RNA IQ 检测进行分析。此外，使用 RETROScript 逆转录酶与 TaqMan hHIF1α 和 hGAPDH 检测进行 RT-qPCR 分析。(A) 来自生物分析仪系统的数据显示 rRNA 峰值随时间快速减少下降，表明 RNA 完整性变差。(B) RIN（黑色点）与 RNA IQ（灰色三角）的对比（包括 40 分钟时间点的更详细结果）显示出不一致，其中 RIN 下降迅速，而 RNA IQ 在较长时间内基本保持稳定。(C) RT-qPCR 结果也较长时间内保持稳定，与 RNA IQ 结果一致，但与 RIN 不一致。

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蛋白质定量数据

准确度和精度

复杂蛋白质混合物中的蛋白质负荷的准确测定。使用 Qubit 蛋白质 BR 检测和标准 Bradford 检测确定几种哺乳动物细胞裂解物中的蛋白质浓度：293T、A549、HepG2、HeLa 和 iPSCs。裂解物使用 Invitrogen NuPAGE 4–12% Bis-Tris Mini 蛋白质凝胶分离并用非染色蛋白质标记试剂标记。(A) 使用 iBright FL1500 成像系统采集的凝胶图像以及 (B) 使用 Invitrogen iBright 分析软件确定的归一化因子。Qubit 蛋白 BR 检测的变异系数 (CV) 显著低于 Bradford 检测。

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内毒素检测数据

高灵敏度和宽范围

样本起始量	无内毒素水稀释	动态范围
5 µL	45 µL	1.0-10 EU/mL
25 µL	25 µL	0.02-2 EU/mL
50 µL	0 µL	0.01-1 EU/mL

Qubit 内毒素检测测定采用简化的单次孵育步骤工作流程，使用 50 µL 样品时可实现 0.01–1.0 EU/mL 的宽检测范围。该测定可使用不同的样品量准确检测最高 10.0 EU/mL。只需选择 Qubit Flex 荧光计主页中的 Endotoxin（内毒素）图标。使用提供的内毒素标准品生成一个 4 点校准曲线，使用 Qubit Flex 无热原检测联管（货号：Q32893）一次可最多同时测量8个样品。

自动计算

预期浓度（EU/mL）	0.010	0.050	0.100	1.00	1.00	5.00	10.00
平均预期浓度（EU/mL）	0.0098	0.045	0.099	0.98	0.97	4.96	10.0
CV	5%	2%	8%	5%	4%	6%	10%
相对误差	2%	11%	1%	2%	3%	1%	0%

与 Qubit Flex 荧光计（货号：Q33327）结合使用时，自动执行计算，有助于减少出错的可能性。Qubit Flex 荧光计使用美国药典所述的经对数转换的线性回归，自动计算相关系数。然后，使用经对数转换的数据和背景校正二次拟合对 Qubit Flex 数据进行分析。使用 Qubit Flex，5 µL 和 50 µL 样本即可生成准确且可重现的结果。5 mL 样本（灰色）的平均 CV 为 <7%，平均相对误差为 <5%。 50 mL 样本的平均 CV <5%，平均相对误差为 <5%。

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锚点列表

Qubit 荧光定量的性能和应用数据