细胞信号 ELISA 试剂盒和多重免疫检测

图2：使用 AKT ELISA 测量 Jurkat 细胞中总 AKT 与磷酸化 AKT 的测量。 将 Jurkat 细胞的渥曼青霉素 (一种 PI-3 激酶抑制剂) 浓度增加 (0~500 nm) ，用于 Jurkat 细胞的处理。用 AKT (Total) Human ELISA 试剂盒 (货号 2373) 裂解细胞，并同时检测 AKT [Total ] 和磷酸化 AKT [pS473] 的情况号  人源 KHO0101) 和 AKT (磷酸化) [pS473] ELISA 试剂盒 (货号. KHO0111) .图表显示，总 AKT 数量保持相当，然而，丝氨酸 473 的磷酸化水平以剂量依赖性方式降低，渥曼青霉素增加。

图3.AKT [pS473] ELISA 的特异性。 进行肽竞争检测，以确认 AKT [pS473] 的特异性。用 AKT (Phospho) [pS473] Human ELISA 试剂盒 (货号 KHO0111)。该图显示，只有对应于丝氨酸 473 周围区域的肽才会阻断 ELISA 信号。

图4.AKT [pS473] ELISA 的分析灵敏度。 Jurkat 细胞在最佳条件下培养，并获得磷酸化 AKT 细胞提取物。在细胞裂解物中使用 AKT (磷酸化) [pS473] Human ELISA 试剂盒 (货号 KHO0111) 和 Western Blot。AKT [pS473] ELISA 的分析灵敏度通过在 30 次检测内获得的平均外径上增加两个标准差来确定。数值 <0.8 单位 /mL 对应于从 4000 个 Jurkat 细胞中提取的 AKT [pS473] 的量。结果显示，根据已知量的 AKT [pS473] 进行检测时， ELISA 的灵敏度是 Western 印迹的 ~2 倍。

图 5.使用 InstantOne ELISA 检测 HEK293 细胞中的人 p38 MAPK [pT180/pY182]。 HEK293 µg 用 2 μ g/mL 茴香霉素 (p38 /JNK MAPK 通路的有效激活剂) 处理 30 分钟 未处理的 HEK293 细胞 (-) 用作阴性对照。通过 Western 印迹 (右) 和 ELISA (左) 用 gp38 MAPK (磷酸化) [pT180/pY182] 多物种 InstantOne ELISA 试剂盒 (货号No. 85-86022-11).通过免疫印迹检测到 38 kDa 条带的强度与 InstantOne ELISA 吸收值有关。

图 6.使用 InstantOne ELISA 检测 C2C12 细胞中的 SMAD1 (总 / 磷酸化)。 C2C12 细胞要么被染色体丙型 (50 mM) 抑制 60 分钟) (-) ，要么被 BMP4 (10 ng/mL) 刺激 30 分钟 (+)。裂解物按照 InstantOne ELISA 用户手册中的说明制备。µg  SMAD1 (10 μ L/ 检测) 或磷酸化 SMAD1 [S463/S465] (右) 检测总 SMAD1 (总 / 磷酸化) InstantOne ELISA 试剂盒 (货号No. 85-86183-11).

A) 对于 ProcartaPlex 测定， Luminex 微球与特异性结合信号转导蛋白的捕获抗体偶联，无论其磷酸化状态如何。特异性抗体与不同微球编码的偶联能够在单个孔中分析多种分析物。创建单独的检测组合，用于使用不磷酸化特异性或磷酸化特异性检测抗体和 PE 染料针对报告通道 1 (532nm) 对总信号蛋白或磷酸化信号蛋白进行多通路分析，使其与所有 Luminex 仪器兼容。

(B) 对于 ProcartaPlex 双报告基因测定，应用相同的捕获抗体，但用于定量磷酸化信号转导蛋白使用磷酸化特异性检测抗体 (带有 BV421 偶联) ，它利用 Luminex xMAP INTELLIFLEX DR-SE 仪器的额外报告通道 2 (405 nm)。使用 PE 染料通过报告通道 1 (532 nm) 检测总蛋白。该方法可同时定量在同一微球上单个孔中的总蛋白和磷酸化蛋白。

图7.比较数据显示了 ProcartaPlex 信号测定与传统 ELISA 的相关性。各种细胞系裂解物重复使用，并在 ProcartaPlex 信号转导 Simplex 试剂盒 (货号EPX010-97101-Pho，货号EPX010-97106-Pho，  货号EPX010-97102-Pho) 和 ELISA 试剂盒 (货号KHO0111，货号KHO0421，货号KHO0241)。  Akt [pS473] 、 PRAS40 [pT246] 和 CREB [pS133]  的测量浓度 数据显示高度相关性 （R2 > 0.8）。这表明， ProcartaPlex 信号单因子检测试剂盒可获得与传统 ELISA 试剂盒相当  的定量结果，并且该试剂盒具有多重技术的额外优势，包括减少样品量，缩短测定 / 手动操作时间以及降低每个数据点的成本。 

图8.ProcartaPlex 和蛋白质免疫印迹的比较数据。使用 Western 印迹和 ProcartaPlex 人 AKT 通路双报告基因检测组合 2x8plex (货号EPX080-97200-DR) 显示了两个检测系统之间的高相关性。Western 印迹数据显示，裂解 NIH-3T3 细胞中的 PRAS40 [pT246] 水平 (40 kDa)。10µg 定量的蛋白 (μ g) 用于蛋白免疫印迹和 ProcartaPlex 检测。ProcartaPlex 人 AKT 通路双报告基因检测组合， 2x8plex (货号按用户指南执行了 EPX080-97200-DR)。在蛋白质印迹分析中，使用 Bolt 4 至 12% ， Bis-Tris ， 1.0 mm ，小型蛋白凝胶 17 个槽 (货号. NW04127BOX）、XCell SureLock 电泳系统（货号 No. EI0002) and PageRulerPlus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa (Cat.号. 26619).然后将分离蛋白 转印到硝酸纤维素膜上 iBlot 2 转印膜组，硝酸纤维素膜 (货号 IB23002)， 带 iBlot 2 干式印迹系统。使用 iBind Solution Kit（货 号 SLF1020)。使用 SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物（货 号. 34577）

图9.ProcartaPlex 信号检测和蛋白质免疫印迹的分析灵敏度比较。Jurkat 细胞在最佳生长条件下培养，并使用细胞裂解物测量磷酸化 CREB。µg 1 ： 2 连续稀释用相同量 (10 μ g) 的蛋白，并使用 ProcartaPlex CREB [pS133] Simplex 试剂盒 (货号. EPX010-97102-Pho) 和 Western 印迹检测。对于 Western 印迹，使用相同的针对 PRAS40 [pT246] 的磷酸化特异性检测抗体，如 Simplex 试剂盒所含。µg 免疫印迹测定的最低浓度为 5 μ L/ 孔 µg ，使用 ProcartaPlex 单因子检测试剂盒测定的最低浓度为 0.6 μ L/ 孔。

图10.常规 ProcartaPlex 和 ProcartaPlex Dual Reporter 规格之间的相关性。ProcartaPlex Human Akt Pathway Dual Reporter Panel, 2x8plex （货号EPX080-97200-DR) 与 ProcartaPlex Human Akt Pathway Panel (total) ， 8plex (货号EPX080-97000-901) 和 Akt Pathway Panel (phospho)， 8plex (货号EPX080-97100-Pho) ，用于评估 AKT 信号转导通路中涉及的总蛋白或磷酸化蛋白。获得的数据表明，双报告基因 Panel 与总蛋白或磷酸化蛋白 (R² > 0.9) 的常规检测组合之间存在强烈的相关性。