流式荧光补偿微球

本页内容：

• 流式荧光补偿微球选择指南
• OneComp及UltraComp eBeads流式补偿微球
• 荧光补偿
• Abc 总抗体及 ArC 胺反应补偿微球
• 荧光蛋白补偿微球

当在单一实验中使用两种或更多荧光染料时，一些特定荧光染料的部分散射光谱可能会与另一种荧光染料的检测范围相重合。为了确保荧光信号的检测具有特异性，荧光补偿的过程就是将混入该通道的其他荧光染料的信号进行数学上的削减。为了计算需要多少量的荧光补偿，必须在每次实验中使用单色对照样品。来自单一荧光染料但在其他通道里被检测得到的信号将会被检测到并通过荧光补偿将相应的信号进行去除。诸如Invitrogen UltraComp eBeads、OneComp eBeads和AbC抗体补偿微球，或者是经过实验中所使用的抗体进行染色的细胞，都可以用作单色对照。

图1： 荧光补偿是通过数学算法对流式细胞数据进行校正来去除光谱的重叠。

荧光补偿微球可为流式细胞分析的补偿设置提供一种一致、准确并简易使用的工具。一致的荧光补偿微球可帮助用户避免因使用较弱荧光样品细胞进行补偿设置时而产生的不良补偿效果。荧光补偿微球可在多色实验的补偿中展现出一流的实用性，并还可与实验中使用的相同抗体进行联合使用（而非例如更亮的CD4替代物）。

荧光补偿微球适用于以下情况：

• 需要使用较强的信号对阳性细胞群进行补偿 
• 使用多孔板或较大规模实验时
• 细胞量有限，不能用于补偿对照

OneComp eBeads流式补偿微球是一种聚苯乙烯微球，在一管中同时含有抗体包被的阳性补偿微球以及未包被的阴性补偿微球。单滴加样使得eBeads加样更为轻松。UltraComp eBeads流式补偿微球具有与OneComp eBeads流式补偿微球相同的优势，但经优化后更适合用于紫色激光，但仍有部分紫光通道不兼容。UltraComp eBeads Plus流式补偿微球完全适用所有紫光通道，与抗体可以结合的物种也增加了兔及人两个种属。

了解更多关于 Ultracomp eBeads Plus及OneComp流式补偿微球的信息

图 2. 采用UltraComp eBeads 以及13种不同的Invitrogen eFluor 450染料偶联单克隆抗体进行染色，包括流失细胞实验中常用的每一种亚类。每种抗体取0.25 ug染色微球并通过流式细胞仪进行分析。每一组直方图代表一种染色的抗体（除大鼠IgG2a及仓鼠抗体的亚型和抗体被标注出，其他克隆及同位型在右侧进行了标注）。

AbC 总抗体补偿试剂盒

三种 AbC 补偿微球试剂盒含有两种类型经特异修饰的聚苯乙烯微球：1）AbC捕获微球（也称为阳性微球），可与所有的特异性免疫球蛋白结合;2）阴性微球，不具有任何抗体结合能力。在与偶联有荧光素的一抗（不同试剂盒可能为小鼠、大鼠、仓鼠或兔抗）进行孵育后，两种不同的补偿微球可达到完全不同的阳性和阴性微球群体用于补偿设置。AbC 微球试剂盒设计用途是在进行阳性微球标记后再加入阴性微球，以避免在荧光逐渐向阴性微球转移。

图 3. 展示AbC 总抗体补偿微球试剂盒染色情况的四个直方图。直方图展示了与小鼠（左上）、大鼠（右上）、仓鼠（左下）单克隆抗体以及兔（右下）单克隆和多克隆抗体结合后，阳性捕获微球与阴性微球的信号分离。捕获微球上标记有最佳量的每种PE抗体偶联物并在Invitrogen Attune声波聚焦流式细胞仪上使用 488 nm激发波长和574/26带通滤波器进行分析。

ArC 胺反应补偿微球

Invitrogen ArC 胺反应补偿微球与 AbC 总抗体补偿微球具有相同的激光兼容性并具有两管形式，但可专门用于补偿 Invitrogen LIVE/DEAD 可固定死细胞染色剂。

图4： 采用 ArC胺反应补偿微球试剂盒以及 3种 LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒得到的染色图谱。 (A) LIVE/DEAD可固定紫色染料染色微球 在405 nm 激发发射并用 450/50 nm 带通滤波器进行收集分析。 (B) LIVE/DEAD可固定绿色染料染色微球 在488 nm 激发发射并用 525/50 nm 带通滤波器进行收集分析。 (C) LIVE/DEAD可固定红色染料染色微球 在633 nm 激发发射并用 660/20 nm 带通滤波器进行收集分析。

BrightComp eBeads荧光补偿微球是经过染色的微球，在GFP、mCherry、RFP、CFP和YFP上都表现有3种强度的荧光特征。BrightComp eBeads可以对样本中的GFP、mCherry、RFP、CFP和YFP轻松完成补偿调节（图5）。这些荧光补偿微球的优势有：

• 轻松完成GFP、mCherry、RFP、CFP和YFP的补偿调节，结果可重复且准确；
• 单管预混，每次一滴，一滴中含有阴性微球和阳性微球，十分轻松上手！

即刻在实验中使用BrightComp eBeads补偿微球，节省更多样本

图5. BrightComp eBeads荧光补偿微球表现出不同的强度。荧光蛋白表达了不同水平，使得流式检测出不同的荧光强度。在补偿调节中建议选择比实验样本表达强度更高的微球波峰。这里的数据是在流式细胞仪上使用488 nm激光和525/50 nm滤光片收集GFP发射光谱，使用561 nm激光和620/15 nm滤光片收集mCherry发射光谱，使用561 nm激光和发射使用585/16 nm滤光片收集RFP发射光谱，使用488 nm激光并使用530/30 nm滤光片收集YFP发射光谱， 使用405 nm 激光器并使用 440/50 nm 滤光片使用 CFP 发射光谱。