3D细胞培养技术-癌症细胞微球-赛默飞

本页内容：

简介
微球开发简史
ECM：一个极具影响力的网络
Nunclon Sphera表面是培养癌症微球的理想选择
缺氧性培养条件

癌症生物学中的微球
结论
方法：癌症微球培养
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参考文献

简介

2D培养的细胞在生理学和细胞反应方面都与体内细胞有所不同。这些不同之处推进了3D细胞培养技术的迅速普及。越来越多的证据表明，3D细胞培养更能代表体内环境，产生更多的生理细胞模型，甚至3D培养细胞基因表达谱反映的临床表达信息也比2D培养细胞更准确[1,2]。微球又称微球培养物，在研究肿瘤和正常组织的生长和功能方面具有巨大潜力，已成为3D体外培养中特别令人振奋的领域。这些微球培养物能够准确反映体内系统，大幅帮助我们研究细胞反应。这主要是因为细胞通常不会孤立地生长或相互作用，而是会与其他细胞和周围微环境产生复杂的相互作用。因此，整合了微球的3D环境能够更近似地模拟体内条件，使研究人员能够将细胞间相互作用、营养梯度和扩散动力学纳入体外模型中。

癌症细胞微球在癌症生物学中具有特殊优势，其与肿瘤具有多种相同的关键组织形态和功能性状，包括细胞-细胞接触形成、增殖减少、存活率升高以及缺氧性核心，在检查肿瘤的生长和行为方面具有重要价值[3,4]。越来越多的研究人员认识到微球培养物作为细胞模型所具有的优势，因此，为更好地帮助实现微球生成、培养和放大，微球的开发工作与日俱增。现在，研究人员正在转向使用先进的培养方法、采用缺氧条件或共培养不同细胞类型，以开发出更加准确的疾病和生理学体外模型。

细胞微球开发简史

自20世纪50年代以来，研究人员一直培养聚集形式的细胞[5]。直到1971年，研究人员使用中国仓鼠V79肺细胞作为结节性肿瘤模型，形成了完美的癌症微球，并创造了“微球（spheroid）”一词[6]。Robert Sutherland的早期研究不仅显示了营养和氧化作用对细胞生长的影响，还实现了对药物或辐射治疗后生长比率的测定。

到20世纪80年代，Mina Bissell及其在美国劳伦斯伯克力国家实验室的团队最先使用了3D技术获得更准确的体内细胞模型。这种背离传统2D培养系统的转变首次被发表，该文章强调了细胞外基质（EMC）的重要性以及微环境的关键作用[7]。这些观察结果对于推动微球培养物作为普遍的生物学相关系统具有重要作用，这种培养方式相比于广泛使用的单层培养方法具有明显的优势。

此后，该领域迅速发展壮大，研究涉及了从小规模疾病建模到大规模高通量筛选（HTS）平台的大量主题，试图解决现有药物发现计划中显现出的损耗率上升问题。

ECM：一个极具影响力的网络

行业已经开始应对这些变化，通过开发专用于培养和维持的设备和方案，包括培养板、合成涂层和细胞骨架，来支持研究中的微球培养。微球生成有多种常用方法，包括液体重叠技术[8]、旋转瓶[9]、回转培养[10]和悬滴法[11]，或者最近利用单孔悬浮培养进行高通量分析[12]。在最初生成微球之后，可利用各种技术进行维持和培养。根据预期应用，微球培养可涉及细胞外基质或骨架、修饰表面、旋转生物反应器、微载体、磁悬浮、悬滴法培养板或磁性3D生物打印。

成功生成和培养微球与ECM有很大关系。ECM通常由可溶性蛋白质和不溶性胶原纤维组成。胶原蛋白形成的刚性结构使组织能够承受拉伸等机械压力，同时，ECM中的蛋白质也参与了许多其他过程。例如，蛋白聚糖能够辅助信号传递、结合生长因子和结合激素，而层粘连蛋白和纤连蛋白等多粘附基质蛋白能够结合胶原蛋白和其他ECM组分。

ECM与细胞质膜接触的点被称为黏着斑。它们的组成在不同组织之间各不相同，但通常由与细胞内和ECM组分相关的整合蛋白分子组成——使这些ECM组分成为细胞内信号传导的功能单位。

ECM对于细胞之间以及细胞与培养容器之间的粘附也很重要。在培养微球时，介导粘附的ECM蛋白将自动粘附到培养容器表面。这会干扰完整的微球形成，并可能导致形成多个微球或卫星菌落。为了优化微球形成，生产商已开发出多种合成修饰的培养容器表面，专用于抑制细胞与培养容器之间的ECM蛋白质粘附，从而促进体外细胞聚集和微球形成。

Nunclon Sphera表面是培养癌症微球的理想选择

Thermo Scientific Nunclon Sphera亲水性聚合物包被表面已被证明能最大限度地减少表面可变性。这种聚合物包被能够阻止ECM粘附到表面，并支持微球的持续形成（图1）。

图1.细胞外基质粘附。与标准细胞培养处理表面相比，Nunclon Sphera表面的胶原蛋白I和纤连蛋白粘附极低。Student’s t-检验，P < 0.01。

Nunclon Sphera培养板通过结合亲水性聚合物涂层与U形底部孔，能够培养微球并且不产生卫星菌落。使用完全DMEM培养基，将HCT 116人结肠癌细胞接种到Nunclon Sphera 96孔U形底培养板中。同样，使用含3%甲基纤维素的完全DMEM培养基，将细胞接种到96孔U形底未处理培养板中。使用不同接种密度的HCT 116人结肠癌细胞，结果显示各个单孔中能够一致地生成边缘清晰的单个微球，（图2）。

图2. Nunclon Sphera培养板相对于未处理培养板和含甲基纤维素的培养基的优势。（A）Nunclon Sphera培养板中生长的癌症微球具有一致的高质量。（B）Nunclon Sphera 96孔U形底培养板中早期形成的单个癌症微球。（由维也纳医科大学医学遗传学研究所Dolznig教授提供。）

为证明微球生长，将A549人腺癌细胞和HCT 116人结肠癌细胞以不同密度接种在Nunclon Sphera培养板中培养2周。根据测量的尺寸，可以证明两种细胞都产生了足够的微球生长（图3A）。另外，使用Invitrogen PrestoBlue细胞存活率测定法评估A549和HCT 116微球的细胞健康状态（图3B）。为实现更好的定量比较，以微球尺寸为基础对数据进行归一化——比例越高，表示微球越健康。进一步使用Invitrogen LIVE/DEAD荧光染色测定法确认癌症微球的细胞存活率（图3C）。所有参数均表明，在Nunclon Sphera培养板上生长的癌症微球健康稳定，因此Nunclon Sphera 96孔U形底培养板是常规和高通量癌症微球应用的可靠和便利工具。

图3. 评估Nunclon Sphera培养板上的微球生长、细胞健康状态和存活率。（A）评估13天内Nunclon Sphera培养板上A549和HCT 116癌症微球的生长动力学。数据以三次重复实验中各细胞数量的平均值±SD表示。（B）使用PrestoBlue细胞存活率测定法评估Nunclon Sphera培养板上的微球细胞健康状态，数据以微球尺寸为基础进行归一化处理。（C）利用LIVE/DEAD荧光染色测定法评估微球细胞存活率，其中活细胞为绿色，死细胞为红色。比例尺= 1,000 μm。

缺氧培养条件

除了需要使用专门的培养容器，培养微球还需要精确控制非生物条件，如温度、湿度和pH。气体条件是细胞培养的另一个重要要求，通常需要补充5-10%二氧化碳以模拟大气氧气压力。然而，虽然大气中的氧含量约为20％，但人体内的氧含量范围可以从12%至最低1%。因此，一些研究人员已开始采用缺氧条件来培养细胞。

早在1972年，Alan Richter及其同事利用1-3％氧气的培养条件来改善小鼠和大鼠胚胎组织的接种效率，发现了氧气的作用[13]。二十一世纪是细胞培养真正到来的时代，其在从常规细胞培养到细胞治疗和个性化药物开发的各个领域都占有一席之地。这些应用使人们重新开始关注细胞培养中使用的氧气浓度，而在过去的十年左右，缺氧条件已走到了微球培养的最前列。

在缺氧条件下培养的细胞生长更快，寿命更长，压力更小。除了控制二氧化碳之外，使用可控制氮气的细胞培养箱是实现缺氧条件的最佳方法。所谓的三气培养箱，如Thermo Scientific Heracell VIOS培养箱，能够优化低氧培养，从而提供最佳的生长和培养稳定性。然而，“三气”一词是一种误称，因为培养箱仅供给二氧化碳和氮气，将内部氧含量降低至1％。

通常，可使用在特定条件下产生荧光信号的化学物质，对缺氧条件进行实时监测。一种特殊的缺氧探针——利用可渗透到活细胞中的荧光化合物并在氧气水平低于5％时发出荧光——能够对细胞缺氧条件进行稳定、可重复的测量（图4）。该试剂优于哌莫硝唑加合物，后者仅对非常低水平的氧气（在≤10mHg的分压）反应，低于发生缺氧时的氧气水平，可能产生假阴性结果。Invitrogen Image-iT缺氧试剂具有更大的灵敏度范围，能够快速响应氧气水平的变化，这使其成为检测3D培养物、微球或神经元中缺氧条件的理想选择[14,15]。

图4. 缺氧条件的检测。使用完全培养基将A549细胞以105个细胞/皿的密度接种到Thermo Scientific Nunc 35 mm玻璃底培养瓶上生长。使用含5 μM Image-iT缺氧试剂（红色）的Gibco FluoroBrite DMEM，在连接到EVOS FL自动成像系统的Invitrogen EVOS Onstage培养箱中，以(A) 20%、(B) 5%、(C) 2.5%和(D) 1%氧气条件培养细胞1小时。随后，对各个氧气水平下的细胞进行成像。当氧气水平低至5%时，可以检测到缺氧信号，在2.5％和1％水平时信号增强。

微球癌症生物学中的应用

微球培养方法大幅促进了我们对细胞生物学的基本了解以及对癌症生物学的深入了解。如前所述，利用200–500 μm微球的多细胞肿瘤微球（MCTS）模型已被用于癌症生物学研究，因为它能够更准确地模拟肿瘤生理学。该模型中的微球与体内肿瘤一样，具有氧气、营养和分解代谢物化学梯度，并具有类似的组织形态和功能特性[16]。微球内部具有与实体瘤内部相同的缺氧性核心（图5），其中细胞快速生长而不再具有血液供应，使肿瘤中心具有极低的氧气浓度。肿瘤的长期缺氧区域特别难以渗透化疗药物，因此具有很高的耐药性[17]。

图5. 用于评估缺氧性核心的单个HeLa微球。将HeLa细胞以1,000个细胞/孔的密度接种到培养板中。在Nunclon Sphera 96孔U形底培养板中培养2天后，使用Image-iT缺氧试剂（红色）和Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes试剂（蓝色）对HeLa微球染色。利用共聚焦显微镜成像。

癌症微球模拟肿瘤关键因素（如缺氧、坏死、血管生成和细胞粘附[20]）的能力备受关注，同时，3D细胞培养物也已被用于广泛的存活率、克隆形成、LD₅₀和转移能力研究。微球系统的多功能性已经改变了我们理解和开发癌症治疗的方式。

微球中的这种氧气含量梯度——从外周含氧量正常的细胞到中心的缺氧细胞——为评估新型药物和药物递送方法提供了极好的模型。MCTS模型可用于验证在缺氧条件下活化的化合物，从而特异性靶向缺氧核心，同时也可用于评估药物和信号通路[18,19]。

结论

微球细胞培养系统不仅对我们理解细胞、组织和ECM之间的相互作用如何影响癌症等病理状态具有重要启示，还有助于开发更稳定的药物筛选平台和改善器官模型。

Nunclon Sphera表面具有极低的ECM结合特性；因此，它能够有效减少细胞粘附并促进微球形成。
Nunclon Sphera 96孔U形底培养板支持各种常用细胞系癌症微球的持续形成和生长。
癌症微球缺氧性核心的证据表明，Nunclon Sphera培养板中的3D癌症微球是理想的肿瘤生长体外模型系统。

方法：癌症微球培养

在用于癌症微球培养前，将癌细胞维持在Thermo Scientific Nunc EasYFlasks细胞培养瓶中。为形成癌症微球，使用含GlutaMAX添加剂和10% FBS、1X MEM非必需氨基酸、100 U/mL青霉素-链霉素以及25 mM HEPES的Gibco DMEM培养基，将细胞以100–5,000个细胞/孔的密度接种到Nunclon Sphera 96孔U形底培养板中（200 μL/孔）。同时，使用含3%甲基纤维素的完全DMEM培养基将细胞接种到未处理培养板中。将培养板以250 x g离心5分钟。随后，将细胞置于37°C和5% CO2环境中培养，每72小时换液，即使用多通道移液器从每孔中移除100μL培养基并补充100 μL新鲜培养基。使用Invitrogen EVOS成像系统检查微球的形成和生长。