注：有关使用任何 Gibco™ 细胞培养产品的完整说明，请访问每个产品页面上的"产品说明"链接。要获取更多技术支持，请致电 800-955-6288。

问："细胞系"、"细胞株"和"细胞类型"之间有何区别？

答： 从组织中分离出细胞以制作原代培养物时，假定细胞在体外增殖，形成一层汇合的单层细胞或致密的细胞悬液。 根据传统定义，该细胞群体的第一次收获和传代培养会形成细胞系 [Freshney, R.I.(1987).Culture of Animal Cells.A Manual of Basic Technique.(New York, Alan R. Liss, Inc.)]。 这种类型的细胞系具有有限的寿命，在此期间具有最强生长能力最高的细胞将占主导地位，从而导致群体中基因型和表型在一定程度上一致。

使用此命名体系时，连续细胞系指经历遗传转化从而具有无限生长潜能的细胞群体。 连续细胞系通常是非整倍体。在实践中，连续细胞系可以通过多次传代培养进行培养，尽管在很高的代次中，可能会发生基因型变化进而导致表型变化。 永生化可以自发发生，或可以由病毒或化学诱导。 请记住，这些术语的工作定义可能因研究组而异。 许多研究人员不使用“细胞系”一词来指代任何群体，除非它经历了遗传转化。 

细胞株指通过克隆或其它一些方法从培养物中阳性筛选的细胞系亚群。 从形成亲本细胞系起，细胞株通常会发生额外的遗传变化。例如，各细胞株可能变得比已建立的细胞系更致癌或更不致癌，或者，在转染步骤后，它们可能被指定为单独株。

细胞类型术语指具有常见表型的所有细胞，如角质化细胞、黑素细胞。 因此，从许多不同供体中分离出的角质形成细胞都是相同的细胞类型。

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问："正常人细胞类型"命名中的"正常"有什么含义？

答："正常"意味着相关细胞是从正常健康组织而非患病组织中分离得到原代培养物。  "正常"也指根据上述传统定义构成细胞系而非连续细胞系的细胞群，因为细胞的基因没有改变且没有无限生长潜能。

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问：群体倍增和代数有何区别？

答： 群体倍增是培养物中细胞总数增加两倍，最常指指数期或“对数”增长期。

术语传代数指细胞群从培养容器中取出并进行继代培养（传代）的次数，目的是使保持细胞保持足够低的密度从而刺激进一步生长。我们将从组织中分离出细胞后的第一次培养物称为原代培养物。  第一次传代培养后，将细胞描述为二级培养物（或第1代）。 第二次传代培养后，细胞将变为三级培养物（或第2代），依此类推。

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问：如何测定悬浮液中细胞的浓度？

答： 请参见使用血细胞计数器计算细胞数的详细实验方案。 

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问：如何从冷冻保存的细胞中建立培养物？

答： 下方程序为利用一个小样品瓶内容物建立培养物的示例方案。

  1. 准备一个装有37°C 水的烧杯。

  2. 取出一瓶液氮储存的细胞，请小心操作以保护双手和眼睛。

  3. 将样品瓶的盖子拧开1/4圈并等待10秒，以释放可能滞留在螺纹中的任何液氮，然后重新拧紧盖子。

  4. 将样品瓶的下半部分浸入 37°C 水中使其解冻。

  5. 当试剂瓶的内容物解冻后，用消毒液擦拭样品瓶的外部并转移到 II 级、A 级层流培养罩。

  6. 打开样品瓶，用 1 mL 移液器上下吹打悬液以分散细胞。

  7. 从样品瓶中取出 20 μL 并在 20 μL 台盼蓝溶液中稀释细胞悬液（例如：货号15250-061）。

  8. 使用血细胞计数器确定每毫升的存活细胞数。

  9. 将样品瓶的内容物 (1 mL) 稀释到产品说明建议的浓度（例如 Gibco™ 新生儿人表皮角质化细胞为 1.25 x 104 个活细胞/mL）。

  10. 向每个 25 cm² 培养瓶中加入 5 mL 细胞悬液或向每个 75 cm² 培养瓶中加入 15 mL 细胞悬液。

  11. 接种后，搅拌培养瓶中的培养基以分散细胞。 许多细胞类型可以快速附着在培养表面上，如果接种后培养基未分散，细胞可能生长不均匀。

  12. 在37°C、含 5% CO²/95% 空气，加湿的细胞培养箱中孵育培养物。 为获得最佳结果，在培养开始后至少24小时内不要干扰培养。


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问：我是否需要从冻存培养基中分离出细胞以进行铺板？

答：我们不建议在铺板前从冻存培养基中分离出细胞。  离心可能对细胞有害，特别是在使用不适当的高速时。 我们细胞培养实验室的经验证明，如果 DMSO 浓度足够低，细胞就不会受到有害影响。 因此，我们的产品说明包括详细的实验方案，即将细胞稀释到培养基中，使在推荐培养基接种密度和体积下最终 DMSO 浓度低于0.4% (v/v)。

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问：我能否扩增您的细胞并重新冷冻它们？如果能，如何操作？

答： Invitrogen Gibco 冻存或增殖培养物可以再次扩增并冻存。 不过，冻存过程可能会导致细胞生长性能的改变。 以下实验方案提供了使用 Invitrogen™ Synth-a-Freeze™ 培养基（一种成分明确的的无蛋白冻存培养基）冻存细胞的基本指导原则。 

请注意：由于冻存设备和各技术存在差异，我们无法承诺使用此实验方案冻存的细胞在从冻存中恢复后会存活，也无法为研究者实验室内冻存的细胞提供质保。

  1. 在 37°C 水浴中解冻或在 4°C 条件下过夜解冻 Synth-a-Freeze 培养基。

  2. 如果在水浴中解冻，温度切勿超过 37°C，切勿延长将产品放在 37°C 水浴中的时间。

  3. 在使用前，应将 Synth-a-Freeze 培养基平衡至 4°C。为获得最佳结果，建议使用速度可控的冻存仪。如果没有速度可控的冻存仪，细胞冻存盒（如 Thermo Scientific™ Mr Frosty™ 容器）可能会有用。

  4. 如果使用酶试剂从培养表面去除细胞，请将细胞重悬于中和酶作用的溶液中。

  5. 通过离心沉淀细胞。

  6. 移除上清液后，将细胞颗粒重悬于浓度为 5 x 105 至 3 x 106 个细胞 /ml 的 Synth-a-Freeze 培养基中。

  7. 将细胞悬液分入适当数量的冻存管中。

  8. 尽快将样品瓶中的细胞冷却至 4°C。

  9. 如果使用速度可控的冷冻仪：以每分钟降低 1°C 的速度来冷冻材料，直至温度达到 -40°。然后，以每分钟 2°C 的速度降低温度，直至温度达到约 -90°C。

  10. 如果使用细胞冻存盒： 按照制造商的说明准备容器。


为获得最佳结果，我们建议在细胞达到 -80°C 后尽快将样品瓶转入液氮储存设施的气相中。

作为 Synth-a-Freeze 培养基的替代品，可以使用冻存的细胞类型推荐的基础培养基，并添加 10% 胎牛血清 (FBS) 和 10% DMSO。 请注意，不建议使用 Synth-a-Freeze 培养基冻存人表皮细胞。 

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问：如何计算正速 (RPM)以用于离心沉淀我的细胞？

答：细胞应在 180 x g（相对离心力，RCF）下离心沉淀。  可以通过测量转子的最大半径并将信息输入本网站上的表格（可通过此链接访问）中来计算正确的转速。例如，在半径为 15 cm 的转子中以 180 x g (RCF) 对细胞进行离心，您可以 1036 rpm 的转速分离细胞。

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仅供科研使用，不可用于诊断目的。