问题

  1. 您对转染试剂的选择有何推荐？
  2. 转染试剂的稳定性如何？
  3. 细胞密度（融合度 %）和传代次数是重要考虑因素吗？
  4. 我能否对不同的细胞系使用等量的任何一种转染试剂？
  5. 我当前使用的孔板尺寸与您的实验方案不同。我如何扩大或缩小转染反应规模？
  6. 在哪里可以找到细胞系特定的转染方案？
  7. 有没有地方可以找到使用过贵公司试剂的其他研究人员提供的参考文献？
  8. 有没有地方可以找到使用过贵公司试剂的其他研究人员提供的参考文献？
  9. 转染过程中，能否在培养基中使用抗生素？
  10. 使用 Invitrogen 转染试剂可以转染哪些类型的分子？
  11. 转染试剂能否用于共转染质粒？我能否共转染质粒和 siRNA？
  12. 对于 RNAi 应用，您建议使用哪种转染试剂？
  13. 为何基因在瞬时转染中的细胞表达水平要高于在稳定的耐抗生素转染中观察到的水平？
  14. 关于将无内毒素 DNA 用于转染，您有何建议？
  15. 您如何通过 A260 读数估算 DNA 含量？A260/A280 是什么意思？
  16. 有时，在加入转染试剂后，我（通过显微镜）在细胞上观察到小颗粒状沉淀物：细胞上的 DNA 复合物。为何会出现这种情况？转染性能会下降吗？
  17. Lipofectamine 2000 与 Lipofectamine 是否相同？Lipofectamine PLUS 与 Lipofectin 呢？
  18. 为何我发现转染效率低下？
  19. 为何在转染后观察到细胞毒性？
  20. 为何我的转染无法重现？

回答

  1. 您对转染试剂的选择有何推荐？

  2. 转染试剂的稳定性如何？
    Invitrogen 转染试剂在湿冰条件运输， 4°C 储存。如果妥善储存和处理，我们保证本产品在购买后六个月内能实现预期性能。我们不建议冷冻转染试剂，因为这样通常会降低转染性能。所有试管均标注了有效期，即生产日期后两年。
  3. 细胞密度（融合度 %）和传代次数是重要考虑因素吗？
    是。细胞密度会影响转染性能。例如，Invitrogen™ Lipofectamine™ 2000 在融合度为 90% 或更高时具有优异的转染性能，而在融合度比这更低时可能观察到一些毒性。我们建议在特定细胞密度（融合度 <70%）下使用 Invitrogen™ Lipofectamine™ LTX。

    传代次数可能影响转染实验。我们建议持续进行细胞分离和铺板。传代次数过多可能降低转染性能。如果转染性能下降，细胞培养时间较长或进行了过度/不当传代，我们建议您从液氮中取一瓶新的细胞，重新开始培养。
  4. 我能否对不同的细胞系使用等量的任何一种转染试剂？
    不能。转染效率很大程度上取决于每个孔所用的试剂量，试剂不同，效率可能会有差异。请查阅转染试剂随附的产品信息，了解合适的使用方法。

    产品附带的实验方案将为您提供各孔需要使用的转染试剂量的理想范围。在产品开发过程中，我们已确定该范围对各种细胞系均适用。如果您在特定细胞系中仍然无法实现理想性能，可能需要进一步优化方案。请联系技术支持，获取关于优化实验方案的更多帮助。
  5. 我当前使用的孔板尺寸与您的实验方案不同。我如何扩大或缩小转染反应规模？
    我们的每种转染试剂方案都提供了扩大或缩小转染规模的参考表。下面提供了 Lipofectamine 2000 实验方案的作为示例。
  6. 在哪里可以找到细胞系特定的转染方案？
    请在细胞特定的转染方案部分查阅相关信息。此处提供了 RNAi 转染的特色方案。
  7. 有没有地方可以找到使用过贵公司试剂的其他研究人员提供的参考文献？
    如果您没有找到细胞系特定的方案或者方案未达到预期效果，我们建议您根据产品随附方案中所述的条件进行测试，以确定优化方案。成功的转染取决于细胞类型、脂质体含量、细胞健康状态或传代次数以及转染时的细胞密度。对不同实验室来说，这其中的每个因素都可能略有不同，可能需要进一步优化方案才能取得相同结果。
  8. 有没有地方可以找到使用过贵公司试剂的其他研究人员提供的参考文献？
    我们的细胞系数据库已更新，纳入了已公布研究结果的研究人员的文章和提及的 Invitrogen 转染试剂。此信息可通过在线目录页面（单击“技术文档”下的蓝色书籍图标）或通过细胞系数据库找到。研发人员还建议使用 www.highwire.org 作为搜索引擎，通过 Invitrogen 转染产品查找大量最新研究文章。只需在搜索条件中包含“Lipofectamine 2000”（或其他 Invitrogen 产品）和目标细胞系/应用即可。
  9. 转染过程中，能否在培养基中使用抗生素？
    可以，我们在多个细胞系中对比了培养基含和不含抗生素时转染细胞的情况，并且评估了转染效率和毒性，发现二者并无差别。要实现稳定转染，转染后请至少等待72小时，然后再加入选择性抗生素。

    更多信息见 Geneticin 的优势。

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  10. 使用 Invitrogen 转染试剂可以转染哪些类型的分子？
    Invitrogen 阳离子脂质体转染试剂可用于转染 DNA、siRNA、Invitrogen™ Stealth RNAi™、dicer 酶生成的 siRNA 库或包含 shRNA 元件的质粒。还可以转染寡核苷酸、蛋白质和 RNA。DNA 可以是质粒、粘粒，甚至是高达 600 kb 的 YAC 克隆。
  11. 转染试剂能否用于共转染质粒？我能否共转染质粒和 siRNA？
    可以使用 Lipofectamine 2000 共转染质粒和 siRNA。请单击此处了解实验方案信息。
  12. 对于 RNAi 应用，您建议使用哪种转染试剂？
    对大多数细胞类型而言，建议使用 Lipofectamine 2000 来瞬时传递 Stealth RNAi、siRNA、dicer 酶生成的 siRNA 库和包含 shRNA 元件的质粒（见下图）。将 siRNA 转染到 HeLa 细胞中时，我们建议使用 Invitrogen™ Oligofectamine™ 试剂。

    Rapid Procedure Lipofectamine 2000
  13.  为何基因在瞬时转染子中的细胞表达水平要高于在稳定的耐抗生素转染子中观察到的水平？
    瞬时转染细胞具有更高的基因拷贝数（每个细胞数百个），因此表达水平也更高。在稳定转染细胞中的表达水平取决于整合拷贝数，通常为每个细胞大约 1-2 个。
  14. 关于将无内毒素 DNA 用于转染，您有何建议？
    处理对内毒素特别敏感的细胞时，一些研究人员更喜欢使用无内毒素 DNA 进行转染实验。为制备无内毒素 DNA，我们提供了许多名为“Invitrogen™ PureLink™ HiPure 纯化试剂盒”且具有多种规格（小量、中量、大量、超大量和宏量）的核酸纯化试剂盒。有关更多信息，请单击此处。
  15. 您如何通过 A260 读数估算 DNA 含量？A260/A280 是什么意思？
    1 A260 单位（H2O 中的质粒 DNA）= 50 μg/mL

    如果质粒 DNA 在 H2O 以外的缓冲液中稀释，消光系数会发生变化。这将改变上文所示的值。

    样品计算：

    质粒 DNA 样品体积 = 100 μL

    稀释度 (1/20) = 25 μL 样品溶于 475 μL H2O 中

    稀释后样品的 A260 = 0.65

    注意：为了获得理想结果，请确保 OD 值介于0.1和1.0之间。

    质粒 DNA 样品浓度 = 0.65 x 50 μg/mL x 20（稀释因子）= 650 μg/mL

    样品中质粒 DNA 含量 = 650 μg/mL x 0.1mL（样品体积）= 65 μg

    A260/A280 值大于或等于1.8意味着质粒 DNA 是纯净的。A260/A280 读数小于1.8表明样品可能受到芳香族产物（即苯酚）或蛋白污染。读数大于2.0则表明样品受到 RNA 污染。
  16. 有时，在加入转染试剂后，我（通过显微镜）在细胞上观察到小颗粒状沉淀物：细胞上的 DNA 复合物。为何会出现这种情况？转染性能会下降吗？
    转染后细胞上出现沉淀物的一个常见原因是 EDTA 过量。我们建议用水稀释 DNA；如果更想用 TE，则使用浓度为 <0.3 mM 的 EDTA。此沉淀物存在与否均不能说明转染性能。
  17. Lipofectamine 2000 与 Lipofectamine 是否相同？Lipofectamine PLUS 与 Lipofectin 呢？
    不。这些试剂都是不同的阳离子脂质体制剂。Lipofectamine 2000 可在较广泛的细胞类型中为质粒 DNA 和 RNAi 的递送提供出色的转染性能。 Lipofectamine 是我们早期销售的一款适用范围广泛的试剂。Invitrogen™ Lipofectamine™ PLUS™ 是一款已停产的转染试剂，不过 PLUS 试剂仍在单独销售（货号 11514-015）。Invitrogen™ Lipofectin™ 试剂最初于20世纪80年代后期推出，是我们最早的一款转染试剂（见下表）。我们继续向喜欢旧试剂的客户销售该产品，但建议所有新客户先试用 Lipofectamine 2000，以实现理想性能。

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  19. 为何在转染后观察到细胞毒性？
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  20. 为何我的转染无法重现？
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