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细胞组分分离和细胞器分离概述
亚细胞组分分离和蛋白富集是蛋白质组学领域快速发展的的重要方法。亚细胞组分的分离和低丰度蛋白质的浓缩可以更有效地鉴别和研究目标蛋白。例如，分离整合膜蛋白或细胞核蛋白。
膜蛋白提取
膜蛋白大约占真核蛋白质组的 30%，是药物发现研究的关键靶标。然而，由于其疏水性，基本性质和大体积，因此很难分离到。
某些去垢剂可用于从细胞溶质（亲水性）蛋白中选择性地提取和分离膜（疏水性）蛋白。例如，Triton X-114 溶液在 0°C（形成澄清的胶束溶液）条件下均质，但随着胶束聚集体的形成，溶液变浑浊，分为 20℃（云点）以上的水相和去污剂相。随着温度的升高，相分离继续进行，直到形成两个清晰的相位。蛋白质根据其亲水性和疏水性进行分区。在疏水组分中富集膜蛋白。
Thermo Scientific Mem-PER Plus 膜蛋白提取试剂盒 可通过使用基于温和去污剂的方案，选择性增溶从培养的哺乳动物细胞或组织中富集整合膜蛋白和膜相关蛋白。传统分离方法通常需要依据疏水性进行分离，而选择性去污剂提取方案可以省去这一繁琐的相分离过程，从而提高了实验的重现性和处理通量。首先使用温和的去污剂对细胞进行透膜处理，使细胞释放可溶性细胞溶质蛋白，然后再使用第二种洗涤剂溶解膜蛋白。
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从不同组织中分离和富集膜蛋白。按照 MEM-PER Plus 膜蛋白提取试剂盒操作步骤，从冷冻的小鼠心脏或大脑 (30 mg) 中分离膜蛋白。通过 SDS-PAGE 分离膜和胞质组分 (10 μg) 并转运到硝酸纤维素膜上。蛋白免疫印迹使用 Thermo Scientific Pierce Fast Western Rabbit Dura 试剂盒 （货号 35071）进行，并与一抗以 1:1,000 的比例稀释。使用 Thermo Scientific myECL 成像仪生成图像。
继续阅读：功能性 G 蛋白偶联受体 (GPCRs) 的提取与纯化
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核蛋白提取
制备良好的核蛋白提取物是许多基因调控研究成功的关键。出于多种原因，使用细胞核提取物代替全细胞裂解物。首先，基因调节领域的许多实验会受到全细胞裂解物中存在的细胞组分的不利影响。其次，目标细胞核蛋白的浓度被全细胞提取物中存在的大量细胞质蛋白稀释。最后，全细胞裂解物因基因组 DNA 和 mRNA 的存在而变得复杂。现在有多种方法可用于分离细胞核和制备核蛋白提取物。但大部分方法都需要机械均质化、反复冻融、冗长的离心或透析过程，这些步骤可能会破坏脆弱的核蛋白的完整性。
Thermo Scientific NE-PER 细胞核与细胞质提取试剂盒 能够逐步裂解细胞，在不到两小时的时间内获取功能性胞浆和核蛋白组分。如果要处理培养的哺乳动物细胞或组织，首先破坏细胞外膜，以获得细胞质内容物，然后从细胞核中提取蛋白。两种组分之间交叉污染的可能性极小 (<10%)。采用这种逐步分离程序，可以在不影响基因调控实验的情况下获得浓缩的细胞核提取物，这在分析全细胞裂解物时很常见。 制备的提取物适用于多种下游应用，包括使用细胞核提取物的电泳迁移率变动实验 (EMSA) ，使用细胞溶质提取物的报告基因测定，Western 印迹，酶测定和 Thermo Scientific Pierce BCA 蛋白测定。
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四种不同 DNA-蛋白复合物的化学发光 EMSA。使用 20 fmol 生物素标记的 DNA 双链（每链 1 种生物素）和 2 µL （6.8 µg 蛋白总量）从 HeLa 细胞制备的 NE-PER 核提取物进行 DNA 结合反应。对于含有特定竞争对手 DNA 的反应，使用 200 倍摩尔过量的未标记的特异性双链。
亚细胞蛋白组分分离
Thermo Scientific 亚细胞蛋白组分分离试剂盒 可从哺乳动物培养细胞或组织中逐步分离并提取细胞质、膜、可溶性细胞核、染色质结合蛋白和细胞骨架蛋白。使用亚细胞蛋白组分分离试剂盒获得的抽提物可与多种下游应用兼容，包括 Western 免疫印迹、各种蛋白检测、电泳迁移率检测和报告基因及酶活性检测。
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使用市售试剂盒进行亚细胞组分分离的示意图。在每个步骤中，上清液包含相应的亚细胞组分，并且沉淀可以用于后续步骤。添加至培养细胞沉淀中的第一种试剂是缓冲液 A，它可对细胞膜进行选择性透化，从而释放可溶性细胞质内容物。第二种试剂，即缓冲液B，可溶解血浆、线粒体和内质网-高尔基体膜，但不溶解核膜。然后通过离心回收完整的细胞核，并进行第三次细胞核提取，使用缓冲液 C 产生可溶性核提取物。如果要提取染色质结合的细胞核蛋白，可以在额外的步骤中将微球菌核酸酶 (MNase) 添加到缓冲液 C 中。然后使用沉淀提取缓冲液 D 提取回收的不溶性沉淀物，以分离细胞骨架蛋白。
通过亚细胞蛋白组分分离可从特定细胞区室进行蛋白定位评估和蛋白富集。亚细胞蛋白组分分离试剂盒含各种试剂，可按步骤在三小时内将细胞裂解为功能性细胞质、细胞膜、可溶性细胞核、染色质连结和细胞支架蛋白。从每个亚细胞区室获得的提取物通常在各组分间有低于 15% 的污染，这是可用于大多数研究蛋白定位和再分布实验的足够纯度。
继续阅读：可提高蛋白质组覆盖率的亚细胞蛋白组分分离方法
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线粒体分离和线粒体蛋白分离
分离完整的线粒体是一种常用的实验室流程，要求进行单样本杜恩斯匀质化。密度梯度离心方法也是有效的，但这通常只能满足大规模需求。当目标是小规模富集线粒体和/或提取线粒体蛋白时，需要采用基于试剂的微量离心机方法。
Thermo Scientific 线粒体分离试剂盒 采用一种非机械，以试剂为基础的方法，可同时处理多份样品（多达 6 份）。使用一种专属配方温和水解培养的哺乳动物细胞团，并在尽量避免损害完整性的情况下获得最大的线粒体产出。提供了优化纯度及产量参数的指南。还包括一项优化杜恩斯均质化程序的说明，与基于试剂的方法相比，该方法可以使线粒体的回收率提高两倍。两种方法用一台台式微量离心机 以不同离心速度分离线粒体和细胞质部分，并在大约 40 分钟内完成（细胞后收获）。一旦被分离，线粒体就可用于下游应用，如细胞凋亡、信号转导和代谢研究，还可用于完成线粒体蛋白质组学工作。
继续阅读：分离功能性突触体的方法
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仅供科研使用，不可用于诊断目的。