细胞裂解和蛋白提取概述

所有细胞都有一个质膜，这是一种蛋白 - 脂质双分子层，是细胞内容物与细胞外环境之间的屏障。组成质膜的脂质是两性的，具有亲水性和疏水性基团，可自发结合形成封闭的双分子片。膜蛋白嵌入脂质双分子层中，由一个或多个跨疏水核心的结构域固定。此外，外周蛋白通过与完整膜蛋白或极性脂质头基团的相互作用，与双分子层的内表面或外表面结合。脂质和蛋白质含量的性质因细胞类型和生物体物种而异。

细胞膜结构。由细胞外膜组成的脂质双分子层的图示。

在动物细胞中，质膜是将细胞内容物与环境隔开的唯一屏障，但在植物和细菌中，质膜也被坚硬的细胞壁包围。细菌细胞壁由肽聚糖组成。酵母细胞壁由两层 ß - 葡聚糖组成，内层不溶于碱性条件。这两种结构均被一层富含甘露聚糖的外糖蛋白层所环绕。植物单元壁由多层纤维素组成。这些类型的细胞外屏障赋予细胞形状和硬度。植物细胞壁特别坚固，因此很难用机械或化学方法破坏。直到最近，酵母细胞的高效裂解还需要使用玻璃微珠进行机械破碎，而细菌细胞壁与其他细胞类型相比则是最容易破坏的。动物细胞没有细胞外壁，因此相对容易裂解。

蛋白样品制备没有通用方案。样品制备方案必须考虑多种因素，例如样品来源或样品类型、蛋白质的化学和结构异质性、目标蛋白质的细胞或亚细胞位置、所需蛋白质产量 (取决于下游应用) 以及建议的下游应用。例如，尿液或血浆等体液已经是更均匀且酶活性低的蛋白溶液，只需稍加处理即可从这些样品中获得蛋白。而组织样品则需要进行大量处理来破坏组织结构、控制酶活性并溶解蛋白。

为某些下游应用提取蛋白质时，分离蛋白质的质量或物理形态也是一个重要的考虑因素。例如，功能性酶联免疫吸附测定 (ELISA) 或晶体学等应用不仅需要完整的蛋白质，还需要具有功能活性或保留 3D 结构的蛋白质。

用于样品收集的蛋白质来源示例。蛋白质可能来自许多来源，包括：哺乳动物细胞培养物、组织或体液等天然来源；细菌、酵母菌、昆虫或哺乳动物细胞等模型系统中的过表达；杂交瘤细胞单克隆抗体；或用于农业生物技术的植物细胞。

一直以来，物理裂解法是细胞破碎和细胞内容物提取的首选方法；然而，这种方法往往需要昂贵、笨重的设备，而且由于仪器的不同(例如松紧不同的均质研杵)，其操作步骤也难以重复。此外，传统的物理破碎方法也不适用于现代实验室研究中典型的高通量和较小体积。

细胞或组织破坏方法。为了针对不同种类的生物、样品类型（细胞或组织）和目标分子或亚细胞结构获得最佳产量和纯度，人们开发了许多细胞裂解方法。细胞裂解方法可分为基于试剂和物理破坏两大类。

近年来，基于去垢剂的裂解方法已经成为主流方法。通过试验和误差的经验检测，开发出了由特定类型和浓度的去垢剂溶液、缓冲液、盐和还原剂组成的不同去垢剂溶液，可为特定物种和细胞类型提供最佳结果。去垢剂兼具裂解和增溶作用。

高质量蛋白质样品的分离是成功完成下游应用的基石。

通过对物理破碎技术、去垢剂缓冲液和密度梯度方法的精心优化，已经开发出能够分离亚细胞结构或化合物类别的各种程序。例如，使用适当的去垢剂，疏水性膜蛋白可以溶解并与亲水性蛋白分离。结合多种工具和步骤，可分离出完整细胞核、线粒体和其他细胞器，用于研究或蛋白溶解。

细胞内的细胞核，线粒体和其他细胞器。

细胞裂解会扰乱受严格控制的细胞环境，从而使内源性蛋白酶和磷酸酶失去调控。因此，提取的蛋白质被这些分子的活性降解或人为修饰。

为防止这些影响，并在细胞裂解中获得最佳蛋白得率，需要向裂解试剂中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。目前已发现并使用了大量化合物，通过可逆或不可逆地与蛋白酶和磷酸酶结合，使其失活或阻断其活性。

细胞和组织提取物中的蛋白质磷酸化得以保留。在不添加磷酸酶抑制剂或有磷酸酶抑制剂的情况下提取蛋白，通过蛋白免疫印迹法检测提取物中总蛋白与磷酸化蛋白的相对水平。在使用 Thermo Scientific Pierce 磷酸酶抑制剂片剂或其他市售磷酸酶抑制剂片剂处理小鼠脑提取物后，测定酸性和碱性磷酸酶活性对蛋白的抑制程度。图片显示了抑制百分比。

当细胞裂解的目的是纯化或测试特定蛋白的功能时，必须特别注意裂解试剂对目标蛋白的稳定性和功能的影响。某些去垢剂会使特定酶的功能失活，提取/纯化蛋白的长期稳定性通常需要从初始裂解试剂中去除和/或通过添加特定化合物使其稳定。

有些细胞裂解和蛋白溶解方法会导致蛋白变性。对这类蛋白质进行功能测试时，需要使其重新复性。通过透析去除变性溶解试剂后，许多蛋白会自发地重折叠成具有功能的天然结构。然而，其他蛋白质在此过程中会折叠成无功能甚至不溶解的形式。在这种情况下，必须对专门的缓冲条件进行测试，以确定哪些缓冲液条件能促进适当复性蛋白质的最高产量。

使用 Pierce 蛋白质复性试剂盒检测复性溶菌酶的结果。每种缓冲液均含有指示变性剂和氧化还原浓度以及 50 mM Tris、18 mM NaCl、8 mM KCl、1 mM EDTA ； pH 值 8.2。 恢复率以重折叠后活性最高的试验 (缓冲液 7) 的百分比表示。与非变性对照组相比，试验 7 代表超过 90% 的溶解溶菌酶复性。(聚乙二醇 (PEG) ；二硫苏糖醇 (DTT) ；还原型谷胱甘肽 (GSH) ；氧化型谷胱甘肽 (GSSG))。

1. Walker JM (2009) The Protein Protocols Handbook.第 3 版.纽约（NY）：Springer-Verlag New York, LLC.
2. Vallejo FL, Rinas U (2004) Strategies for recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins.Microb Cell Fact 2:3(1):11.