蛋白质糖基化

糖基化是内质网 (ER) 和高尔基体中生物合成 - 分泌途径的关键功能。通常在细胞中表达的所有蛋白中，约有一半都要经过这种修饰，即在特定氨基酸上共价添加糖基。在内质网中表达的大多数可溶性和膜结合蛋白在某些程度上发生糖基化，包括分泌性蛋白、表面受体和配体以及细胞器驻留蛋白。此外，一些从高尔基体运输到细胞质的蛋白也发生糖基化。脂质和蛋白聚糖也可能发生糖基化，从而显著增加这种类型修饰的底物数量。

范围 

蛋白糖基化在细胞中具有多种功能在 ER 中，糖基化用于监测蛋白质折叠的状态，用作质量控制机制，以确保仅将正确折叠的蛋白质运输至高尔基体。可溶性蛋白上的糖部分可以与 反式 高尔基体网络中的特定受体结合，以促进其递送到正确的目的地。这些糖还可作为细胞表面受体的配体，介导细胞附着或刺激信号转导途径 (1)。由于寡糖可能非常大且笨重，因此它们可通过促进或防止蛋白与同源相互作用结构域结合来影响蛋白间的相互作用。由于它们具有亲水性，因此也会改变蛋白的溶解度 (2)。

分布

糖基化蛋白（糖蛋白）存在于几乎所有已研究的生物体中，包括真核生物、真细菌和古菌 (3,4)。真核生物具有表达糖蛋白的生物种类最多，从单细胞生物到复杂的多细胞生物。

糖蛋白多样性

糖基化将蛋白质组的多样性增加到任何其他翻译后修饰所无法比拟的水平。细胞能够促进这种多样性，因为几乎可以修饰糖基化的每个方面，包括：

• 糖苷键—聚糖（寡糖）结合的位点
• 聚糖成分—与特定蛋白连接的糖类型
• 聚糖结构—分支或非分支
• 聚糖长度—短链或长链寡糖

由于涉及大量的酶步骤，糖基化被认为是最复杂的翻译后修饰 (5)。糖基化的分子事件包括将单糖连接在一起，将糖从一种底物转移到另一种底物，以及将糖从聚糖结构中剪切。与转录或翻译等其他细胞过程不同，糖基化是非模板化的，因此，所有这些步骤并不一定发生在每次糖基化过程中。细胞不使用模板，而是依赖于大量酶，这些酶将糖从一个分子添加或移除到另一个分子上，从而生成在特定细胞中所见的多种糖蛋白。由于涉及到所有酶，糖基化的不同机制看似杂乱无章，实则是高度有序的分步反应，其中单个酶的活性取决于前一个酶反应的完成情况。由于酶活性因细胞类型和细胞内室而异，细胞可以合成在聚糖结构中与其他细胞不同的糖蛋白 (5)。

将单糖或寡糖从供体分子转移到生长寡糖链或蛋白质的酶称为糖基转移酶 (Gtf)。每个 GTF 均具有特异性，将来自供体（糖核苷酸或多萜醇）的特定糖连接至底物，独立于其他 Gtf 发挥作用。这些酶的作用范围广泛，因为几乎每个蛋白质功能基团都检测到糖苷键，并且糖基化已被证明在一定程度上结合了大多数常见的单糖 (6)。

糖苷酶催化糖苷键水解以去除蛋白中的糖类。这些酶对于 ER 和高尔基体中的聚糖加工至关重要，每个酶均具有去除特定糖（例如，甘露糖苷酶）的特异性。

基化的类型

根据糖肽键和所附寡糖的性质，糖肽键可以分为特定类别，包括 N-、O- 和 C-糖基化、糖基磷脂酰肌醇化和磷酸糖基化。由于 N- 和 O-糖基化和糖基磷脂酰肌醇化是最常检测到的糖基化类型，因此本文将更多地强调这些修饰。

蛋白不限于特定类型的糖基化。实际上，蛋白通常在具有不同糖苷键的多个位点发生糖基化，这取决于多种因素，包括以下所述因素。

1.酶的可用性

糖基化通过将蛋白迁移到不同酶浓度的区域来控制；细胞将酶隔离到特定区域以调节其活性。例如，蛋白在 ER 中被 N-糖基化后，通过将蛋白转运至含有高浓度特异性 Gtf 和糖苷酶的不同高尔基体中，以逐步方式发生聚糖加工。

2.氨基酸序列

除了需要正确氨基酸（例如，ASN 用于 N-连接；Ser/Thr 用于 O-连接）外，许多酶都具有能够形成糖苷键的共有序列或基序 (6)。

3.蛋白构象（可用性）

当合成蛋白时，它们开始折叠成新生的二级结构，这可能会使特定氨基酸无法与糖苷键结合。因此，标靶氨基酸必须具有构象可及性才能发生糖基化。

糖蛋白对生物过程和疾病状态的影响不断扩大，以提高灵敏度和通量促进检测和分析策略的发展，从而更好地了解其多样化结构和生物化学。由于糖蛋白是蛋白和寡糖的组合，因此分析起来比非糖基化蛋白更复杂。此外，聚糖结构和成分的多样性也增加了糖蛋白分析的复杂性。

聚糖染色或标记

由于其结构，聚糖的糖部分不会与染色或标记分子发生反应。为了克服这一问题，可以用高碘酸对糖基进行化学重组，高碘酸将糖（特别是唾液酸）上的邻位羟基氧化为醛或酮，然后与多种染料发生反应。高碘酸 - 席夫 (PAS) 染色剂使用该反应来检测和定量各种生物样品中的糖蛋白。高碘酸也可用于使糖与交联剂发生反应，交联剂可共价结合标记分子（例如生物素）或固定化支持物（例如链霉素亲和素）以进行检测或纯化。以下两种代表性蛋白凝胶比较了聚糖和考马斯蛋白染色的使用情况。

使用糖蛋白染色试剂盒对糖基化蛋白进行灵敏、特异性的染色。在相同的聚丙烯酰胺凝胶中电泳相同的蛋白样品，然后使用 Thermo Scientific Pierce 糖蛋白染色试剂盒（左）或使用 Thermo Scientific GelCode 蓝色染色试剂 右）进行染色以检测总蛋白。糖蛋白染色试剂盒仅检测到含有不同糖基化量的 5 或 6 种蛋白。每个面板的左侧泳道均为预染 MW 标记物。

糖蛋白纯化或富集

凝集素可用于检测和分析糖蛋白功能 (52)。这些聚糖结合蛋白对不同的糖部分具有高特异性。如前所述，凝集素可促进 ER 中的蛋白质折叠，但它们对于细胞-细胞和病原体-细胞的附着至关重要。虽然抗聚糖抗体也可以结合糖部分，但凝集素比抗体更常用，因为凝集素成本更低、表征更好、更稳定 (52)。像抗体一样，凝集素也可与辣根过氧化物酶、荧光基团和生物素等探针偶联，并固定在固体支持物中，包括链霉素亲和素和 Thermo Scientific NeutrAvidin 蛋白。凝集素的一些常见用途包括：

• 糖蛋白鉴定
• 糖蛋白纯化/富集
• 细胞表面糖复合物（例如糖蛋白、糖脂、GPI 锚定分子）的表征
  • 检测相对丰度
  • 识别组织和细胞定位
• 糖基化突变体的产生
• GTF 和糖苷酶活性分析

很多凝集素可从市场上购得，在此类应用中使用。很多凝集素可从市场上购得，在此类应用中使用。 最受欢迎的凝集素为来自刀豆的刀豆蛋白 A (ConA)，但其他凝集素，包括木菠萝凝集素、小麦胚芽凝集素 (WGA) 和扁豆凝集素 (LCA)，也在不同的商业试剂盒中广泛可用。 这些代表性银染凝胶比较使用不同糖蛋白分离试剂盒得出的结果。  

从人血清和细胞裂解物中分离糖蛋白—使用 ConA 树脂对试剂盒进行性能比较。用 Thermo Scientific Pierce糖蛋白分离试剂盒、ConA 和其他市售 ConA 树脂处理中国仓鼠卵巢 (CHO) 蛋白裂解物和人血清样品。对每种树脂加入等量的总蛋白。将洗脱的糖蛋白组分与在 SDS-PAGE 缓冲液中煮沸的 ConA 树脂进行比较，以释放凝集素。所有组分均按体积标准化，并在 8-16% 聚丙烯酰胺凝胶上分离。然后对凝胶进行银染。（右）来自应用 CHO 裂解物的洗脱糖蛋白组分；（左）来自应用人血清的洗脱糖蛋白组分。Arrow 可识别洗脱过程中由树脂浸出的 ConA 产生的蛋白条带。

通过质谱分析进行糖蛋白组和糖组学分析

糖蛋白与其他翻译后修饰蛋白不同，因为它们是蛋白部分和聚糖部分的组合，两者均占分子分子量的很大比例。因此，可以将糖蛋白作为一个整体或作为单个组分进行分析。糖蛋白组学是糖基化蛋白质的整体分析，整合了糖蛋白富集和蛋白质组学分析，用于复杂系统中糖蛋白的系统鉴定和定量。蛋白质组学的该亚群与糖组学不同，糖组学仅限于系统中的所有聚糖（即糖基化）(53)。

与其他蛋白质组学分析一样，使用质谱法进行糖蛋白鉴定和定量。糖蛋白组学分析的基本流程包括 (53)：

• 糖蛋白或糖肽富集
• 液相色谱法 (LC) 多维分离
• 串联质谱法
• 通过生物信息学进行数据分析

这种方法可以在通过聚糖内切酶 H（内源性 H）或肽-N4-（N-乙酰-β-葡糖胺基）天冬酰胺酶 (PNGase) 酶切割前或后进行，具体取决于实验类型。可通过细胞培养 (SILAC) 试剂中氨基酸的差异标记技术与稳定同位素标记进行定量比较糖蛋白组学分析。此外，还可使用同位素标记的"重"参比肽，通过选择反应监测 (SRM) 对目标糖蛋白进行绝对定量。

糖蛋白质组学分析。糖蛋白首先被酶切为糖肽，或者直接通过液相色谱和串联质谱 (LC-MS/MS) 进行分析或者首先去糖基化，然后在分析前富集用于多糖或肽。

糖基化有多种类型和机制，最常见的类型是 N-糖基化。糖基化通常被表征为翻译后修饰。虽然其他类型的糖基化也是如此，但 N-糖基化通常发生在共翻译，即在新生蛋白被翻译并转运至 ER 的过程中，聚糖附着在新生蛋白上。此类糖基化名称中的 "N"表示，聚糖共价结合天冬酰胺（ASN 或 N）残基上的甲酰胺氮。

由于 ER 是大多数膜结合蛋白和分泌性蛋白的翻译和加工位点，因此其中大多数是 N-连接糖蛋白就不足为奇了。除了是最常见的糖基化类型（90% 的糖蛋白为 N-糖基化）外，N-连接糖蛋白还具有大的且通常广泛的分支聚糖，在与蛋白结合后会经历多个加工步骤。

N-糖基化的结构。

N-糖基化在真核生物和古菌中是保守的，所涉及的大量酶和过程在不同的物种中也是保守的 (7)。N-糖基化可分为不同的事件，如下所示：

• 前体聚糖组装
• 附件
• 修剪
• 成熟

如前所述，糖基化过程中的每个步骤都需要不同的酶，这有助于产生的聚糖的多样性 (8,9)。但所有蛋白的 N-糖基化最初都是相同的，直到随后的修剪和聚糖成熟时，这种多样性才显现出来 (7)。

前体聚糖组装

通过 N-糖苷键连接的寡糖来源于由 N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc)、甘露糖 (Man) 和葡萄糖 (GLC) 组成的 14-糖前体分子。这些糖会连续添加到多萜醇中，多萜醇是一种嵌入 ER 膜的聚异戊二烯脂质载体 (8,10)。前 7 种糖由细胞质中的糖核苷酸（UDP- 和 GDP-糖）提供，并通过焦磷酸键 (-PP-) 与多萜醇结合。在 Man₅GlcNAc₂-PP-多萜醇中间体完成后，整个复合物被翻转到 ER 腔中，随后 Man- 和 Glc-P-多萜醇分子提供最后的 7 个糖，形成Gcl₃Man₉GlcNAc₂-PP-多萜醇前体聚糖。

聚糖附着

糖基化通常被表征为翻译后修饰。虽然其他类型的糖基化也是如此，但 N-糖基化通常发生在共翻译，即在新生蛋白被翻译并转运至 ER 的过程中，聚糖附着在新生蛋白上。此类糖基化名称中的"N"表示，聚糖共价结合天冬酰胺（ASN 或 N）残基上的甲酰胺氮。

由于 ER 是大多数膜结合蛋白和分泌性蛋白的翻译和加工位点，因此其中大多数是 N-连接糖蛋白就不足为奇了。除了是最常见的糖基化类型（90% 的糖蛋白为 N-糖基化）外，N-连接糖蛋白还具有大的且通常广泛的分支聚糖，在与蛋白结合后会经历多个加工步骤。

多糖组装和附着。前体聚糖合成从内质网 (ER) 的细胞溶质表面开始，并在结构翻转至 ER 腔后完成。然后寡糖转移酶 (OSTase) 将前体聚糖转移到新生蛋白上的 ASN 残基中。

需要注意的一个方面是，并非所有具有预测共有序列的 ASN 残基都被糖基化。N-端至 C-端蛋白合成可在相同方向将生长多肽转运至 ER ，并且在多肽进入 ER 后不久即发生蛋白折叠。因此，随着蛋白折叠增加，OSTase 获得聚糖转移的共有序列的能力降低。事实上，N-端 Asn 残基糖基化的数量要多于 C-端 Asn 残基。

ER 中的聚糖修剪 

通过水解法，糖苷酶在 ER 和高尔基体中修剪寡糖。但在 ER 中修剪聚糖与在高尔基体中修剪有着不同的用途。

在 ER 中，糖水解用于监测蛋白折叠并指示蛋白何时降解。葡萄糖苷酶 I 和 II 从前体聚糖中去除 2 个端 Glc ，然后用钙联蛋白和钙网蛋白（分别为膜结合和可溶性糖结合凝集素）通过剩余的 Glc 与新生糖蛋白结合，并作为伴侣蛋白帮助蛋白正确折叠。最终的 Glc 很快由葡萄糖苷酶 II 水解，从伴侣蛋白中释放糖蛋白。非天然折叠蛋白被 UDP-葡萄糖糖蛋白葡萄糖基转移酶识别，将 Glc 转移至糖蛋白，蛋白再次结合凝集素伴侣蛋白，以促进蛋白的正确折叠 (12)。这一 Glc 添加和去除循环将持续进行，直至蛋白正确折叠，此时它不再被糖基化，糖蛋白被运输至高尔基体以进行进一步加工 (13)。在高等真核生物中，进入高尔基体的所有正确折叠糖蛋白的聚糖结构是 Man9GlcNAc2。

ER驻留-甘露糖苷酶 (ERManI) 在鉴定无法正确折叠的蛋白方面起着关键作用。通过 ERManI 活性在 ER 中失去 3-4 个甘露糖残基的蛋白被转运出 ER，并被聚糖酶 N 去糖基化（整体去除整个 聚糖）并递送至 ER 相关降解 (DXT-RAD) (14,15,16,17)。人们认为 ERManI 可以充当某种计时器，因为它的甘露糖水解速率较慢，使得新生蛋白可以进行多轮再聚糖基化尝试在去除甘露糖残基之前正确折叠，并使蛋白靶向降解 (18)。

高尔基体中的聚糖成熟 

到糖基化过程中的这个点，所有 N-连接糖蛋白都具有相同的前体聚糖结构。高尔基体中的聚糖加工结合了修剪和添加糖，以使单个糖蛋白上的聚糖多样化。与前体聚糖生物合成一样，这种产生不同寡糖的成熟途径高度有序，因此每个步骤都依赖于上一步。为此，高尔基体可将特定酶分离成不同的池，从而促进这一逐步进行的过程。

高尔基体酶区室化。介导高尔基体聚糖加工的酶将被分离到不同的池中，以确保糖基化以逐步方式进行。

最终的聚糖结构可以大致分为两组：

• 复合寡糖—含有多种糖类型
• 高甘露糖寡糖—多个甘露糖残基
• 混合—高甘露糖和复合寡糖的分支

目标为复合寡糖的聚糖由高尔基体甘露糖苷酶 I 和 II 修剪，并被 GlcNAc 转移酶糖基化，从而形成共同的核心区域 (7,12)。然后，核心成为多种 Gtf 的底物，依次从糖核苷酸转移糖部分以构建 GlcNAc、半乳糖 (Gal)、N-乙酰神经氨酸（Nana 或唾液酸）和岩藻糖的可变长度和分支寡糖链。任何在常见核心阶段进行此加工过程中发生的糖蛋白都会因糖苷酶 H (endo H) 而对聚糖去除产生抗性，且通过实验确定糖蛋白是否含有高甘露糖或复合寡糖。

与复合寡糖不同，高甘露糖寡糖不会携带其他糖部分，尽管某些 Man 残基通常会被高尔基体甘露糖苷酶 I 修剪。聚糖是否会被加工成复合寡糖而不是残留的高甘露糖寡糖取决于加工酶对聚糖的可及性，糖蛋白构象可能会阻碍这一过程。一些糖蛋白具有混合寡糖，由复合物和高甘露糖聚糖的组合组成。

聚糖成熟。在 ER 中初次修剪后，糖蛋白被运输至高尔基体，其中高尔基体甘露糖苷酶 I 可去除多个甘露糖。不再进行糖基化的聚糖被称为高甘露糖寡糖。进一步加糖和去除糖会产生一种共同的核心寡糖，多个 Gtf 会将不同的糖添加到寡糖上以生成高度可变的复合寡糖。超出共同核心的聚糖成熟提供了内源性 H 不敏感性。聚糖可以是高甘露糖、复合物或两者的组合（即混合寡糖）。

虽然 N-糖基化是最常见的糖苷键，但 O-糖蛋白还在细胞生物学中发挥着关键作用 (19)。这种糖基化对于黏蛋白的生物合成至关重要，黏蛋白是一类高度 O-糖基化、高分子量的蛋白家族，可形成粘液分泌物。O-糖基化对于蛋白聚糖核心蛋白的形成也至关重要，这些蛋白用于制备细胞外基质组分。此外，抗体通常大量存在 O-糖基化。

O-糖基化在高尔基体中的丝氨酸和苏氨酸侧链翻译后进行。N-糖基化并不妨碍其他糖基化的发生，因为 O-糖基化通常发生在 ER 中 N-糖基化的糖蛋白上。O-糖基化除了连接方式不同外，糖基化的方式也不同。前体聚糖  通过 N-糖基化整体转移转移到 Asn，将糖一次一个添加至丝氨酸或苏氨酸残基上。O-糖基化也可以发生在羟基赖氨酸和羟基脯氨酸上，分别是赖氨酸和脯氨酸的氧化形式，存在于胶原蛋白中 (19)。此外，O-连接聚糖通常比 N-连接聚糖具有更简单的寡糖结构。

机制 

O-糖苷机制不如 N-糖基化复杂。转运至高尔基体的蛋白通常由 N-乙酰半乳糖胺 (GalNAc) 转移酶进行 O-糖基化，其可将单个 GalNAc 残基转移到丝氨酸或苏氨酸的 β-OH 基团上。迄今为止，该酶没有已知的共有序列，尽管已表征结构基序。根据细胞和物种的不同，一些蛋白被 GlcNAc、岩藻糖、木糖、半乳糖或甘露糖 O-糖基化 (6,20)。与 N-糖基化一样，糖核苷酸用作 O-糖基化的单糖供体。在第一个糖之后，会连续添加数量各异的糖（从仅几个到超过 10 个）到不断增长的聚糖链中。O-糖基化也可以发生在细胞溶质和细胞核中，以通过其他 Gtf 调节基因表达或信号转导 (21)。

糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 锚定的共价结合是一种常见的翻译后修饰，可将蛋白定位到细胞膜上。这种特殊的糖基化在真核生物和一些古菌的表面糖蛋白上广泛检测到 (22)。

GPI 锚定包括：

• 与靶蛋 C 端结合的磷酸乙醇胺接头
• 聚糖核心结构
• 固定膜结构的磷脂尾

聚糖核心尾部的脂质部分和糖残基均具有相当大的变异 (23,24,25,26,27,28)，显示出巨大的功能多样性，包括信号转导、细胞粘附和免疫识别 (29)。GPI 锚定剂也可被磷脂酶 C 等酶切割，用于调节锚定于质膜上的蛋白定位。

机制

与用于 N-糖基化的前体聚糖相似，GPI 锚定生物合成始于 ER 的细胞质小叶，在腔侧完成。在这一过程中，3–4 甘露糖和各种其他糖（如 GlcNAc、Gal）分别使用 ER 内外的糖核苷酸和多萜醇-P-甘露糖捐赠的糖，构建到嵌入膜中的磷脂酰肌醇 (PI) 分子上。此外，2-3 个磷酸乙醇胺 (ETN-P) 接头残基由 ER 腔中的磷脂酰乙醇胺提供，以促进锚与蛋白的结合 (30,31,32,33,34)。

注定要被磷脂酰化的蛋白具有 2 个信号序列：

• 一种引导共翻译转运到 ER 的 N-端信号序列
• 一种由 GPI 转酰胺酶 (GPIT) 识别的 C-末端信号序列 (29)

GPIT 没有共有序列，但可以识别 C-端序列基序，使其可以共价连接 GPI 锚定到序列中的氨基酸。该 C-端序列在翻译后被立即嵌入 ER 膜中，然后蛋白从序列中切割并附着到预先形成的 GPI 锚定上 (35,36,37)。

C-甘露糖基化代表了一种不同的糖基化方法，因为该反应形成碳-碳键而不是碳-氮键或碳-氧键。C-甘露糖基转移酶 (c-Mtf) 将甘露糖 C1 与色氨酸 (38) 吲哚环 C2 连接 (38)。该酶可识别特定序列 Trp-X-X-Trp，并将甘露糖残基从多萜醇-P-Man 转移到序列中的第一个 TRP (39,40,41)。

已在多种细胞系 (42) 和大鼠肝微粒体 (40) 中检测到 C-甘露糖基化。C-糖基化的特定蛋白包括 Rnase (43) 中的 Trp2、促红细胞生成素受体和 IL-12B (5)。C-糖基化的生物学功能未知，但当前的研究主要集中于植物、昆虫和细菌合成 C-糖基化分子用于药物研发，因为它们对代谢水解具有抗性。

这种类型的翻译后修饰仅限于寄生虫（例如 利什曼虫 和锥虫)）和黏菌（例如 网柄菌），其特征是通过磷酸二酯键将聚糖与丝氨酸或苏氨酸连接 (44)。在某些寄生虫物种中，例如 利什曼原虫，磷酸聚糖化是最丰富的翻译后修饰 (45,46)，可用于制备蛋白磷酸聚糖 (PPG)，这对于保护免受宿主补体 (47) 和促进宿主寄生虫聚集至关重要 (48)。与 N-糖基化相似，磷酸聚糖化通过磷酸糖基转移酶 (PTase) 从膜结合分子转移预制磷酸聚糖发生，但确切结构和酶因物种而异 (44)。

除了在同一蛋白上发生的多种类型的糖基化外，可以进一步修饰聚糖，以增加给定蛋白质组中糖蛋白的多样性。这些修饰包括：

• 在糖胺聚糖 (GAG) 的生成过程中，Man 和 GlcNAc 残基发生硫酸化，糖胺聚糖是细胞外基质中的蛋白聚糖的组分
• 唾液酸的乙酰化促进蛋白-蛋白相互作用 (49,50,51)
• 磷酸化，例如与溶酶体前体蛋白（甘露糖-6-磷酸）上的 Man 残基进行磷酸化，以确保高尔基体通过与甘露糖-6-磷酸受体 (M6PR) 结合而被运输至溶酶体

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