定形内胚层分化的培养系统与试剂

在细胞分化成下游内胚层谱系之前，诱导 PSC 分化生成定形内胚层细胞是重要步骤。何不更快地完成这一步骤？与其他分化方案*相比，PSC 定形内胚层诱导试剂盒产生细胞的时间缩短了 50%，并且不需要预分化或混合培养基。

使用 PSC 定形内胚层诱导试剂盒生成的细胞在多个细胞系中显示 ≥90% 的 CXCR4⁺/PDGFRα^– 并表达关键标志物 Sox17 和 FoxA2。

图 1.PSC 定形内胚层诱导试剂盒培养基可在 hESC 和 iPSC 细胞系（包括游离型和 CytoTune 重编程细胞系）中高效 (>90%) 生成定形内胚层细胞群。代表性点阵图显示了 CXCR4⁺/PDGFRα^– 细胞群。在每个实验中，未染色的细胞用于设置象限门。

图 2.经 PSC 定形内胚层诱导试剂盒培养基处理的 hESC 的免疫细胞化学分析。在第 3 天，对诱导细胞中的内胚层转录因子 Sox17 和 FoxA2 以及多能标志物 Oct4 进行免疫染色。细胞核用 DAPI 进行复染（蓝色）以评估细胞总数。

使用此试剂盒生成的功能性细胞能够分化为表达相关生理标志物的中肠/后肠、胰腺内胚层或肝芽祖细胞。数据由新加坡基因组研究院的L.T. Ang、K.M. Loh 和B. Lim 提供

• 根据 Gibco PSC 定形内胚层诱导试剂盒（Gibco DE 试剂盒）产品说明书，将 H9 ESC 以 20% 的密度接种到添加了含有 RevitaCell 的 Essential 8 (E8) 培养基的 Matrigel 包被 6 孔板上。
• 为了诱导分化为定型内胚层，在接种后第 1 天将培养基更换为 DE 试剂盒培养基 A，第 2 天则更换为 DE 试剂盒培养基 B。
• 在第 3 天，根据每个实验方案遵循肝细胞谱系形成方案，并一直持续到肝细胞谱系最终形成。
• 每日采集形态图像。从在 E8 中培养 3 天的 H9 细胞、第 3 天的 DE 诱导细胞中，以及在每个实验方案的肝细胞谱系最终形成时收集蛋白质和 RNA。

肝细胞分化实验方案 1： Szkolnicka D, Farnworth SL, Lucendo-Villarin B, and Hay DC.从多能干细胞分化出功能性肝细胞. Curr Protoc Stem Cell Biol, 30:1G.5.1-1G.5.12, 2014.
肝细胞分化实验方案 2： Hannan NR, Segeritz CP, Touboul T, and Vallier L. 从人多能干细胞中产生肝细胞样细胞. Nat Protoc, 8(2): 430-7, 2013.

代表性数据显示使用两种不同的已发表方法将 hESC 分化为肝细胞时 Gibco DE 上游的效用。

A. 在 E8 培养基中培养 3 天的 hESC H9 细胞、在第 3 天经 Gibco DE 试剂盒培养和处理的 hESC H9 细胞，以及在每种测试方法的分化方案结束时在 DE 下游生成的肝细胞样细胞的代表性图像。B. 对上述细胞进行 qRT-PCR 分析以确定其干性（Nanog、Oct3/4）、向定形内胚层分化的诱导（CXCR4、FOXA2），以及肝细胞标志物（AFP 和白蛋白）的最终表达。C. 与 HepG2 和原代肝细胞相比，使用 Gibco DE 试剂盒和两种分化方法生成的细胞的蛋白质印迹分析。正与预期一样，E8 和 DE 细胞不表达肝细胞标志物，而两个分化的细胞群均显示出 AFP 和白蛋白的特殊存在，代表其肝细胞样表型。请注意，HepG2 细胞表达 AFP 和白蛋白，而原代肝细胞仅表达白蛋白，表示其完全成熟的表型，其特征在于缺乏 AFP。另请注意，如较弱的肌动蛋白条带所示，原代肝细胞系上样不足。

通过以下简单步骤生成高质量定形内胚层：

1. 使用 CytoTune-iPS 2.0 仙台病毒重编程试剂盒将体细胞高效重编程为多能干细胞 (PSC)。
2. 使用 Essential 8 培养基进行 PSC 无饲养层培养和扩增。
3. 使用 PSC 定形内胚层诱导试剂盒在 2 天内诱导分化为定形内胚层。
4. 分化为所需的终末谱系。
   
   

* 针对 STEMdiff™ 定形内胚层试剂盒提供的实验方案根据已发布的网页实验方案提供估计值。

仅供科研使用。不可用于诊断程序。