RNA 转染指南

RNA 转染是将 RNA 导入细胞的经典转染技术的分支。RNA 转染的目的与质粒转染相似。将 mRNA 导入细胞旨在表达编码蛋白以及研究基因功能和调控。siRNA 用于评估基因敲低影响的 RNAi 研究。这两种方法的一个主要区别是 RNA 只能进行瞬时转染。

下图描绘了 siRNA 设计和合成后的 RNAi 实验工作流程。在进行 RNAi 实验时，请确保您已具备：

• 转染/电穿孔的相应试剂和方案
• 用于评估敲低和其他 RNAi 效应的检测方法
• 阳性和阴性对照 siRNA
• 目标基因的两个或两个以上 siRNA

图1：siRNA 设计和合成后的 RNAi 工作流程

当用户需要同时将 siRNA 和表达某种蛋白的质粒引入细胞中时，可采用共转染法。该蛋白可以是试验系统的一部分，大多数情况下为报告基因（荧光素酶、GFP、β-内酰胺酶）。在某些情况下，用户可能想要在存在 siRNA 的同时表达一种突变蛋白，即利用 siRNA 阻断一个通路的同时，过表达一种突变蛋白。

当使用脂质体转染试剂时，质粒的存在可能会降低所有携带物（质粒和 siRNA）的转染效率，因此，转染优化非常重要。如果转染条件不佳，可能出现脂质体过多导致的非预期和非特异性细胞死亡，也可能出现敲低过少或质粒的蛋白表达过少。

siRNA 的质量可显著影响 RNAi 实验。siRNA 必须不含合成时残留的试剂，如乙醇、盐和蛋白质。此外，长于 30 bp 的 dsRNA 污染物据悉可通过激活非特异性干扰素应答和引起细胞毒性而改变基因表达（Stark 等人，1998）。因此，我们建议使用大于 80% 全长的标准纯度 siRNA。

siRNA 的最佳量及其对基因的沉默能力在一定程度上受到靶基因产物特性的影响，包括 mRNA 定位、稳定性、丰度以及靶蛋白的稳定性和丰度。

尽管许多 siRNA 实验仍然使用 100 nM siRNA 转染细胞，但已发表的结果表明，使用更低浓度的 siRNA 进行转染可以降低 siRNA 的脱靶效应（Jackson 等人，2003；Semizarov 等人，2003）。对于脂质体介导的反向转染，10 nM 的 siRNA（范围 1-30 nM）
通常已足够。如果使用电穿孔递送 siRNA，则 siRNA 数量的影响不太明显，但通常 1 μg/50 µL 细胞 (1.5 μM) 的 siRNA（范围 0.5-2.5 μg/50 µL 细胞或 0.75-3.75 μM）已足够。

请记住，虽然过多的 siRNA 可能导致脱靶或细胞毒性作用，但过少的 siRNA 可能不会有效降低靶基因表达。由于涉及到如此多的变量，因此请务必针对所用的每个细胞系优化 siRNA 量。此外，非靶向阴性对照 siRNA 的量应与实验 siRNA 相同。

转染试剂的体积是关键优化参数，用量太少会限制转染，太多会导致毒性。整体转染效率受与 siRNA 复合的转染试剂用量的影响。为进行优化，在较宽的稀释范围内进行转染试剂滴定，并选择能够获得良好基因敲低的最大稀释浓度。对于每个细胞系，应根据经验确定这一关键体积。

虽然细胞密度对于需要提前铺板的传统转染实验很重要，但在通过反向转染递送 siRNA 的实验中，细胞密度不太关键，几乎不需要优化。然而，如果使用的细胞过多且 siRNA 的量没有按比例增加，则样本中的 siRNA 浓度可能太低，无法有效引发基因沉默。当细胞密度过低时，培养物可能变得不稳定。各孔的不稳定性可能存在差异，因为培养条件（例如，pH 值、温度）在多孔板中可能不均一，会对不稳定培养物产生不同的影响。

尽管大多数转染试剂的设计原则是尽可能减小细胞毒性，但如果过量使用转染试剂或暴露时间过长，也可能对细胞培养物的整体健康产生不利影响。敏感细胞可能在暴露于转染试剂数小时后开始死亡。如果转染导致细胞过度死亡，应在 8-24 小时后去除转染混合物并补充新鲜的生长培养基。

转染试剂与 siRNA 形成复合物应在减血清或无血清培养基中进行，从而避免血清成分干扰该反应。然而，形成复合物后，一些转染试剂可允许在含血清的正常生长培养基中进行转染（请遵循生产商的说明）。转染后通常不需要添加或替换培养基，但在某些情况下，即使使用的是血清相容试剂，改变培养基也可能有益。在使用特定试剂之前，请务必核实其血清相容性。一些转染试剂在转染过程中需要无血清培养基，并在与转染复合物初始孵育后更换为完全生长培养基。