用于溶酶体、过氧化物酶和酵母液泡的标记染料探针——第 12.3 节

Molecular Probes 的酸促试剂可用于染色溶酶体和酵母液泡，以及几种其他类型的酸性细胞器，如转高尔基体囊泡、内体和成纤维细胞中包膜囊泡的亚群、胰岛素分泌的胰腺 β 细胞中的分泌囊泡、精子的顶体和植物液泡。 溶酶体包含糖苷酶、酸性磷酸酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶、羧肽酶和多种其他蛋白酶。酶底物和检测—第 10 章 描述了多种底物，用于检测这些水解酶的活性。一本关于影响细胞内运输过程（通过溶酶体、高尔基体和内质网）的人类疾病的优秀汇编已经出版。

与溶酶体一样，过氧化物酶体是含有消化酶的单膜结合囊泡。这些基本细胞器的最主要功能是通过酶促作用氧化脂肪酸，并随后催化分解 H₂O₂，后者是脂肪酸降解的副产物。最近，人们对过氧化物酶体的兴趣不断增加，特别是在与过氧化物酶体来源和维持相关的研究中。 与疾病状态和饮食有关的过氧化物酶体形态异常也一直处于当前研究的主题。SelectFX Alexa Fluor 488 过氧化物酶体标记试剂盒 (S34201) (如下所述) 提供了一种基于抗体的方法来标记固定细胞过氧化物酶体。

CellLight 试剂将靶向荧光蛋白的实用性和选择性与 BacMam 基因传递和表达技术的效率相结合。这些试剂包含了 BacMam 技术的所有常规优势，包括哺乳动物细胞的高效转导以及持久的可滴定表达 ( BacMam 基因传递和表达技术 - 注 11.1)。CellLight试剂以即用型形式提供—只需添加、培养和成像即可—在细胞系、原代细胞、干细胞和神经元中具有高效的表达。CellLight 试剂及其靶向序列的完整列表见 CellLight 试剂及其靶向序列 - 表 11.1。

CellLight 溶酶体 -GFP (C10507， C10596) 和 CellLight 溶酶体 -RFP (C10504， C10597 ； 图 12.3.1) 是 BacMam 表达载体，编码绿色荧光蛋白 (GFP) 或红色荧光蛋白 (RFP) 与来自 Lamp1（溶酶体相关膜蛋白 1）的靶向序列的融合蛋白。这些 CellLight 试剂会在固定和透化过程后残留的活细胞中产生溶菌体局部荧光标记，该标记在固定和渗透程序后仍会保留，而 LysoTracker Red DND-99 染色则会在这些程序中被消除。 BacMam 载体的滴定表达容量在 Lamp1-GFP 融合的背景下特别有用，因为高水平的过表达有时会诱导晚期内吞细胞器的异常聚集。

CellLight 早期内体– GFP (C10586， 图 12.3.2) 和 CellLight 早期内体– RFP (C10587) 试剂提供用小 GTPase Rab5a 编码 GFP 或 RFP 融合的 BacMam 表达载体。Rab5a 与自身荧光蛋白融合，可作为敏感、精确的内吞体早期标记物，用于实时成像内吞体沿微管的运输（图 12.3.3）以及活细胞中由蛋白聚糖介导的内吞作用。 我们还提供 CellLight 晚期内体– GFP (C10588) 和 CellLight 晚期内体– RFP (C10589) 试剂，它们是对 GFP 或 RFP 与晚期内体蛋白 Rab7a 的融合进行编码的 BacMam 表达载体。

CellLight 过氧化物酶体 -GFP (C10604 ，图 12.3.4) 是一种 BacMam 表达载体， 可编码 C 端的 GFP，并标记过氧化物酶体靶向序列 (PTS1)。使用 GFP – PTS1 融合进行活细胞成像提供了许多对过氧化物酶体正常和病理异常生物生成和降解以及过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR) 的影响的控制信息。

LysoTracker 探针

弱碱性胺能在低内部 pH 值的细胞区室中选择性地发生积累，并可用于研究溶酶体的生物合成和发病机制。 DAMP 是一种常用作为酸性细胞器探针的弱碱性胺；然而，DAMP 不发荧光，因此必须与抗 DNP 抗体 (抗染料和抗半抗原抗体 - 第 7.4 节) 结合使用，以便直接或间接地与荧光基团或酶偶联，以显示染色模式。 荧光探针 中性红 (N3246) 和 吖啶橙 (A1301， A3568 ) 也通常用于酸性细胞器的染色，尽管它们缺乏特异性。

这些限制促使我们寻找可替代的酸性细胞器选择性探针，这两种探针都可用于短期和长期的追踪研究。LysoTracker 探针是一种荧光酸多效探针，可用于标记和示踪活细胞中的酸性细胞器。这些探针有多种重要特征，包括对酸性细胞器具有高选择性以及可有效标记纳摩尔浓度的活细胞。此外， LysoTracker 探针有多种荧光颜色可供选择 ( LysoTracker 和 LysoSensor 探针的总结—表 12.3， 图 12.3.5) ，使其特别适用于多色应用。

LysoTracker 探针由一个与弱碱相连的荧光团组成，该弱碱在中性 pH 值下仅部分质子化，可自由渗透细胞膜，并通常集中在球形细胞器中 ()。我们发现，荧光 LysoTracker 探针必须在极低浓度 (通常约 50 nM) 下使用，以便获得极佳选择性。它们的保留机制尚未得到充分证实，但很可能涉及细胞器膜上的质子化和保留，尽管染色通常不会通过随后对具有弱碱性细胞可透过性化合物的细胞进行处理而逆转。LysoTracker 探针内化的动力学研究表明，这些染料进入活细胞的速率可在数秒内完成。遗憾的是，这些溶酶体探针对溶酶体产生碱化作用，因此使用这些探针进行更长的孵育时间会诱导溶酶体 pH 增加。因此，我们建议在成像前使用这些探针仅在 37°C 下孵育一至五分钟。

使用 LysoTracker Red DND-99 (L7528； ， ) 染色的细胞区室较大，通常在醛固定后仍保留了染色模式。当通过适合荧光素的带通滤光片组或适合罗丹明的长通滤光片组观察时，两种溶酶体染料—LysoTracker Yellow HCK-123 (L12491) 和 LysoTracker Red DND-99 (L7528)—同时染色产生的染色图案完全相同（）。LysoTracker 探针主要为荧光显微镜检测应用而开发。LysoTracker 染料染色细胞中的溶酶体荧光因其自发荧光或非特异性染色而仅占细胞总荧光的一部分。因此，通过流式细胞术或荧光测定法成功应用这些探针来定量溶酶体数量，可能取决于特定的细胞系和使用的染色方案。

LysoTracker Deep Red 染料 (L12492) 具有与 Cy5 荧光通道完全匹配的激发和发射特性，从而有助于 GFP 和 RFP 标记物的多重成像； LysoTracker 深红染料是 GFP、RFP 和蓝色荧光反染剂四色成像的理想标记（图12.3.6）。溶酶体定位的 GFP 表达（使用 CellLight 溶酶体-GFP）与 LysoTracker 深红色荧光共同证实了 LysoTracker 深红色染料对溶酶体的选择性（图12.3.6）。LysoTracker Green DND-26 (L7526) 用于在促进锌囊泡隔离的膜蛋白研究中识别酸性区室， 可目视观察罗丹明 B 在减 牛骨骼肌中标记的酸性细胞器，并评估冻存牛精子球蛋白的丙烯部分完整性。 这种 LysoTracker 探针还被证明可用于通过小脑体胞吐作用分泌肺表面活性剂的连续检测。 LysoTracker Red DND-99 为研究人员提供了用于检测布鲁氏锥虫在特异性摄取细胞因子肿瘤坏死因子-α 后溶酶体损伤的探针，用于研究器官发生阶段小鼠胚胎的细胞凋亡，以及用于确定受体和通道蛋白的亚细胞定位。

Image-iT 活细胞内膜及细胞核标记试剂盒

Image-iT LIVE 溶酶体和细胞核标记试剂盒（I34202）提供两种染料—红色荧光 LysoTracker Red DND-99 染料（激发/发射最大值约为 577/590 nm）和蓝色荧光 的 Hoechst 33342 染料（与DNA结合时的激发/发射最大值约为 350/461 nm）—用于分别对活细胞中（已转染绿色荧光蛋白（GFP）的）溶酶体和细胞核进行高选择性染色()。根据样品实验方案使用时，细胞通透性 LysoTracker Red DND-99 可提供高选择性的溶酶体染色，且背景极低。在甲醛固定后，虽然可能会观察到一些细胞质背景染色，但仍可保留大量特异性染色。Hoechst 33342 染料是一种细胞渗透性核酸染色剂，对 DNA 具有选择性，光谱与 DAPI 相似，可被紫外线激发，并与 DNA 结合后发出蓝色荧光。这种染料不会干扰 GFP 荧光，在固定和渗透后仍能保留。不建议将染料混合在一个染色溶液中，而应在单独的标记步骤中使用，首先使用 Hoechst 33342 染色。

Image-iT活细胞质膜及细胞核标记试剂盒包含以下成分：

• LysoTracker Red DND-99
• Hoechst 33342 染料
• 标记方案 (Image-iT LIVE 溶酶体和核标记试剂盒) 

每个试剂盒都提供足够的染色溶液，可用于 500 次检测，按照提供的方案对贴附在盖玻片上的活体培养细胞进行标记。。

LysoSensor探针

对于研究活细胞中溶酶体生物发生和功能的动态方面的研究人员，我们开发了 LysoSensor 探针—一种可进入酸性细胞器的荧光 pH 指示剂。LysoSensor染料是一种亲酸性探针，在质子化作用下会积聚在酸性细胞器中。此质子化还可以消除弱碱性侧链对染料的荧光淬灭作用，从而导致荧光强度增加。因此，与 LysoTracker 探针相比，LysoSensor 试剂在酸化时荧光强度会随着 pH 值升高而增加，而 LysoTracker 探针在酸性 pH 值下荧光强度不会显著增强。

我们提供三种颜色不同的 LysoSensor 试剂和 pK_a ( LysoTracker 和 LysoSensor 探针的总结—表 12.3)。由于这些探针可能定位在细胞器的膜中，因此（ LysoTracker 和 LysoSensor 探针摘要——表 12.3）中列出的 pK_a 值可能与细胞环境中测得的值不同，因此只能对细胞器 pH 进行定性和半定量的比较。绿色荧光 LysoSensor 探针在酸性或中性范围内 (在水缓冲液中pK_a ~5.2 或 ~7.5) 可提供极佳 pH 值灵敏度。LysoSensor Blue DND-167 (L7533) 和 LysoSensor Green DND-189 (L7535) 的 pK_a 值较低，因此除非在酸性环境中，否则几乎不发光。LysoSensor Yellow/Blue DND-160 (PDMPO ， L7545) 的独特之处在于，它显示出 pH 值依赖的双激发和双发射光谱峰 (图 12.3.7， )。

LysoSensor Yellow/Blue DND-160 主要在酸性细胞器中发黄色荧光，在酸性细胞器中则显示蓝色荧光。双发射测量有助于对酸性细胞器（如溶酶体、 髓细胞白血病细胞 和植物细胞的酸性液泡）中的pH值进行比率成像。 LysoSensor Yellow/Blue DND-160，通常简称为 PDMPO，已被广泛用于追踪海洋硅藻中二氧化硅的沉积和迁移。 LysoSensor Yellow/Blue DND-160 内部化研究表明，探针可在数秒内被活细胞吸收。遗憾的是，这种溶酶体探针可对溶酶体产生碱化作用，因此使用该探针进行较长孵育时间会诱导溶酶体 pH 增加。因此，仅当孵育时间短时，才是有用的 pH 指示剂；我们建议在成像前仅孵育一至五分钟。

细胞渗透性溶酶体传感器可单独或组合使用，用于研究细胞内溶酶体的酸化以及溶酶体功能或运输的变化。例如，在某些肿瘤细胞中，溶酶体 的 pH 值低于正常溶酶体，而其他肿瘤细胞含有更高 pH 值的溶酶体。 此外，囊性纤维化和其他疾病会导致某些细胞内细胞器酸化缺陷， LysoSensor 探针可用于研究这些异常。 LysoSensor Green DND-189 已被用于选择性标记颗粒细胞神经突触内的酸性区室 ，并与 LysoSensor Green DND-153 一起用于检测突变 CHO 细胞系中内体和溶酶体的酸化。 LysoSensor Yellow/Blue DND-160 已被用于一项研究，该研究证明溶酶体参与了多柔比星选择的人类 U-937 髓细胞白血病细胞变种获得性耐药表型的形成。

与 LysoTracker 探针一样，细胞渗透性 LysoSensor 探针最初是为荧光显微镜应用而开发的。LysoSensor 染料染色细胞的溶酶体荧光会因细胞自发荧光或非特异性染色而仅占细胞总荧光的一部分。因此，通过流式细胞术或荧光测定法成功应用这些探针来定量溶酶体数量或 pH 值，可能取决于特定的细胞系和使用的染色方案。

LysoSensor Yellow/Blue 葡聚糖

我们已制备 LysoSensor Yellow/Blue dexye (L22460) 的 10,000 MW 的葡聚糖偶联物。由于这种标记的葡聚糖被细胞吸收并通过内吞途径移动， LysoSensor 染料的荧光会在近中性内体中从蓝色荧光变为酸性溶酶体中的更长波长的黄色荧光。 在pH值约为 3.9 时，染料 pK_a 附近荧光发射发生最大变化。与细胞可透过性 LysoSensor 染料不同， LysoSensor Yellow/Blue 葡聚糖可采用荧光显微镜 () 或流式细胞分析技术测量溶酶体 pH 值。

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DAMP 的选择

试剂部分 (N- (3- (2 ， 4- 二硝基苯) 氨基) 丙基) -N- (3- 氨基丙基) 甲胺，二盐酸盐) 是一种在活细胞的酸性细胞器中吸收的弱碱性胺。可使用抗 DNP 抗体 (抗染料和抗半抗原抗体 - 第 7.4 节) 检测这种细胞可透过性酸离子试剂，包括用 Alexa Fluor 488 染料、生物素、Qdot 655 纳米晶体或酶标记的试剂， 这使得 DAMP 广泛适用于通过电子显微镜和光学显微镜检测酸性细胞器。例如，DAMP 已被用于研究：

• 胞吞和分泌途径
• 囊性纤维化患者细胞中细胞内细胞器酸化存在缺陷
• 依赖于 β 细胞中胰岛素原转化为胰岛素的 pH 值
• 自噬液泡的发育
• 病毒感染期间细胞内酸性区室的位置

作为DAMP 的替代品，我们上述的细胞可透过性荧光 LysoTracker 和 LysoSensor 探针在这些应用中具有显著潜力。由于 LysoTracker 和 LysoSensor 试剂可直接可视化而不需要任何二级检测试剂，因此研究人员能够研究酸性细胞器并遵循活细胞中的动态过程。

RedoxSensor Red CC-1 染色剂

RedoxSensor Red CC-1 染色剂（2 ， 3 ， 4 ， 5 ， 6- 四氟甲基二氢罗丹明）被动进入活细胞，随后在细胞质中氧化为红色荧光产物（最大激发 / 发射波长 ~540/600 nm），然后在线粒体中蓄积。或者，这种非荧光探针可以被运送到溶酶体，在那里被氧化。线粒体和溶酶体之间氧化产物的差异分布似乎取决于细胞质的氧化还原电位。 在增殖细胞中，线粒体染色占主导地位；而在接触抑制的细胞中，染色主要出现在溶酶体中 ()。我们发现的定量氧化产物分布的最佳方法是使用线粒体选择性 MitoTracker Green FM 染色剂 (M7514) 与 RedoxSensor Red CC-1 染色剂。

其他溶酶体亲和探针

BODIPY FL 组胺结合了不敏感于 pH 值的亮绿色荧光染料 BODIPY FL 和组胺的弱碱性咪唑部分。在低浓度条件下使用时，该探针可选择性地对溶酶体 () 进行染色。

我们的高纯度中性红（N3246）是一种常见的溶酶体探针，可将溶酶体染成荧光红色。 它还可用于在微孔板测定中测定贴壁细胞和非贴壁细胞 的数量，以及对脑组织进行细胞染色。

DNA插入剂吖啶橙（A1301、A3568）也被报道是一种有用的溶酶体试剂。

酵母液泡的生物发生作为真核细胞器组装的模型系统，已经得到了广泛的研究。 研究人员结合使用遗传和生化方法，分离了大量酵母菌液泡蛋白分选 (VPS) 突变体 ，并鉴定出负责细胞质酸化的质体H⁺-ATP酶（V-ATP酶）。 为便于研究酵母液泡结构和功能，我们提供膜可透过性试剂和 酵母液泡标记物采样试剂盒 (Y7531)。

FUN 1 酵母细胞重要染色剂

FUN 1 Vital Cell Stain (F7030) 利用其内源性生物化学处理机制，这些机制在不同物种酵母菌和其他真菌中似乎非常保守。 当以微摩尔浓度使用时， FUN 1 细胞染色剂可由多种酵母菌和真菌自由吸收，并从扩散分布的黄绿色荧光细胞内染色剂细胞内染色剂库转化为紧凑的橙红色荧光囊泡结构 ()。这种转换需要质膜的完整性和代谢能力。只有代谢活跃的细胞才能清晰地显示出荧光内腔结构，而死细胞则呈现出极其明亮、漫射的黄绿色荧光 （图 12.3.8, ）。FUN 1 染色已用于检测针对 念珠菌 属的抗 真菌活性以及通过流式细胞分析测量真菌对杀菌剂杀菌的敏感性。 FUN 1 细胞染色剂也可作为 LIVE/DEAD 酵母细胞活力检测试剂盒 (L7009 ，细胞活力和细胞毒性检测试剂盒，适用于多种细胞类型—第 15.3 节) 的组分。

FM 4-64 和 FM 5-95

据报道，我们的 FM 苯乙烯染料 FM 4-64 能够选择性地使酵母菌质膜呈现红色荧光  （激发/发射最大值约为 515/640 nm）。动态、研究内吞途径以及筛选和鉴定酵母内吞突变体的重要工具。 我们提供  1 mg 小瓶装的 FM 4-64 （T3166）或特别包装的 10 小瓶每瓶 100 mg（T13320）。FM 染料的成功应用案例越来越多，这促使我们合成  FM 5-95 （T23360），这是一种亲脂性稍弱的 FM 4-64 类似物，具有基本相同的光谱特性。

酵母液泡标记物采样试剂盒

酵母液泡标记物采样器套装 （Y7531）包含一系列新型和成熟的液泡标记物探针，这些探针有望用于酵母细胞生物学研究：

• 5- (和 6-) 羧基 -2' ， 7'- 二氯荧光素二乙酸酯 (羧基 -DCFDA) 
• CellTracker Blue CMAC 
• 氨基肽酶底物 Arg-CMAC ()
• 二肽基肽酶底物 Ala-Pro-CMAC
• 酵母液泡膜标记物 MDY-64  ()

我们的实验表明，7-氨基-4-氯甲基香豆素（CMAC）的几种细胞渗透衍生物大部分被隔离在酵母液泡中。已知相应的 7- 氨基 -4- 甲基香豆素衍生物是酵母液泡酶的底物。 该采样器试剂盒的三个基于香豆素的液泡标记物可选择性地对酵母液泡腔进行染色。为了补充腔体的蓝色荧光染色，我们提供了一种对酵母液泡膜进行染色的新型绿色荧光膜标记物 MDY-64。如上所述，也可使用红色荧光探针 FM 4-64 完成膜染色。常用液泡标记物 5- (和 6-) 羧基 -2' ， 7'- 二氯荧光素二乙酸酯 (羧基 -DCFDA) 可用作标准品。 酵母液泡标记物采样试剂盒中的三种组分—CellTracker Blue CMAC （C2110， 膜渗透反应示踪剂——第 14.2 节）、专有 酵母液泡膜标记 MDY-64  （Y7536）和羧基-DCFDA（C369， 存活和细胞毒性分析试剂——第 15.2 节）—也可单独购买给发现其中一种染料非常适合其应用的研究人员。

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过氧化物酶体是大多数真核细胞中的一种单膜囊泡，其功能是通过酶促作用氧化脂肪酸，并随后催化分解 H₂O₂（脂肪酸降解的副产物）。过氧化物酶体大小与溶酶体 (0.5 – 1.5 µm) 相似。SelectFX Alexa Fluor 488 过氧化物酶体标记试剂盒（S34201）提供了标记固定细胞中过氧化物酶体所需的所有试剂，包括细胞固定和通透试剂。为了专门检测过氧化物酶体，该试剂盒使用了一种针对过氧化物酶体膜蛋白 70（PMP 70）的抗体，该蛋白是过氧化物酶体中含量丰富的整合膜蛋白，以及一种 Alexa Fluor 488 染料标记的二抗（）。Alexa Fluor 488 染料显示出明亮绿色荧光，与适合荧光素的滤光片和仪器设置兼容。PMP 70 在服用降血脂药物后显著增加，同时伴有过氧化物酶体增殖和过氧化物酶体脂肪酸 β-氧化酶的诱导。

各 SelectFX Alexa Fluor 488 过氧化物酶体标记试剂盒包含：

• 兔 IgG 抗过氧化物酶体膜蛋白 70 (PMP 70) 抗体
• 高度交联吸附的 Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG 抗体
• 浓缩固定液
• 磷酸盐缓冲溶液（PBS）
• 浓缩透化液
• 浓缩封闭液
• 哺乳动物细胞制备和染色的详细方案 (SelectFX Alexa Fluor 488 过氧化物酶体标记试剂盒)

有关列标题的详细说明，请参阅 数据表内容的定义