人新生儿成纤维细胞的分离、原代培养和冻存

目的

下文介绍了在非动物源性 (AOF) 或含血清条件下从包皮组织中分离和建立人新生儿成纤维细胞原代培养物的推荐程序。还包括传代培养和冻存程序。

介绍

来自皮肤（真皮）的原代人成纤维细胞有助于进行许多科学研究（包括生长因子作用研究、伤口愈合研究、毒性/刺激性研究），并可作为胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的饲养细胞。我们提供完整的产品系列，适用于这些细胞在非动物源性条件或含血清条件下的分离、生长和冻存。以下实验方案介绍了从新生儿组织中分离细胞的方法。与成人皮肤的真皮组织相比，新生儿真皮组织包含更多细胞和更少的细胞外基质。此外，新生儿细胞本身具有比年长者细胞更长的寿命。如果需要从成人皮肤中进行分离，请考虑使用更大量的起始组织并提高胶原酶浓度。

通用指南

• 在 II 级 A2 型层流罩中使用无菌技术执行所有实验方案
• 在分离程序中应始终佩戴双层手套、护目镜并穿着实验服
• 处理人体组织时采取通用预防措施，并妥善处置受污染的材料。

准备组织

本程序描述了从新生儿包皮组织中制备成纤维细胞的过程。如果您正在处理更大的组织块，请对实验方案进行相应的调整。

1. 要制备含添加剂的成纤维细胞 AOF 培养基，请在一瓶 500 mL 的成纤维细胞 AOF 基础培养基 (FABM) 中加入以下物质：

• 成分明确的成纤维细胞 AOF 添加剂 - 5 mL
• 100X 抗生素-抗真菌剂液体 (AA) - 5 mL

要制备血清补充培养基，请在一瓶 500 mL 的 D-MEM 培养基中加入以下物质：

• 胎牛血清 (FBS) - 55 mL
• 100X 抗生素-抗真菌剂液体 (AA) - 5.5 mL

2. 将吸收性衬垫放入层流罩中。
3. 向 100 mm 无菌培养皿中加入约 10 mL 在步骤1中制备的补充培养基。
4. 获取组织并将包含组织的容器放入层流罩中。
5. 取下 100 mm 培养皿的盖子，并将其倒置放入层流罩中，以在下面的步骤8中使用。
6. 使用无菌镊子将组织转移到步骤3中制备的培养皿中。
7. 通过使用镊子搅拌 100 mm 培养皿中的培养基来洗涤组织。
8. 使用无菌镊子将组织铺展平放于 100 mm 培养皿的翻转盖上，表皮侧朝下。如果组织处于管状结构中，请使用小号无菌剪刀切开组织并将其铺展平放在盖子上。
9. 使用无菌剪刀和镊子剪掉所有脂肪和松弛的筋膜。为防止组织变干，请每隔几分钟放入 100 mm 培养皿内的培养基中冲洗一次。
10. 修剪完成后，使用无菌解剖刀将组织切割成大约 0.5 cm × 1.5 cm 的组织条。

分散酶酶解

1. 向无菌 15 mL 锥形离心管中加入 5 mL 分散酶溶液。
2. 将上文步骤10中切割的组织转移到含有分散酶溶液的试管中。确保组织块浸没在溶液中。盖紧试管。
3. 取下外层手套，用杀结核菌溶液擦拭瓶外侧。适当标记试管。
4. 将试管转移到 4°C 冷藏冰箱中。
5. 在 4°C 下孵育试管 16–21 小时。

真皮细胞分离和铺板

1. 分散酶酶解后，取回含有组织的试管，并将试管放入层流罩中。
2. 取出一个 100 mm 无菌培养皿，然后取下盖子并将盖子倒置放入层流罩中。
3. 将酶解的组织和附带的分散酶溶液转移到 100 mm 培养皿底部，避免飞溅。如有任何组织块留在瓶中，请使用 1 mL 无菌移液器或无菌镊子将组织块转移到 100 mm 培养皿底部。
4. 将表皮与真皮分开。
   
   
   • 一次处理几块组织，将组织块移动到培养皿的翻转盖上。调整组织条的方向，使表皮朝上。
   • 用一把无菌镊子固定组织条的真皮，用另一把无菌镊子固定表皮边缘。撕开/剥离真皮与表皮，使其分开位于同一盖子上。快速操作，为每个组织块重复该过程。
     
     
5. 向一个新的 100 mm 无菌培养皿中添加 10 mL 补充培养基
6. 使用无菌镊子将分离的真皮组织块转移到包含培养基的 100 mm 培养皿中，使真皮-表皮交界朝上。要分离和培养表皮细胞，请参阅人角质形成细胞的分离、原代培养和冻存实验方案。
7. 一次操作一块真皮，将一块真皮放入 100 mm 组织培养皿的无菌盖中，并使用无菌解剖刀的刀片用力彻底刮除真皮-表皮交界表面，以减少此处的微血管。为每一块真皮重复该过程。
8. 在包含步骤5中制备的 10 mL 补充培养基的 100 mm 培养皿中洗涤真皮块，然后将其转移到清洁、干燥的 100 mm 组织培养皿的底部。
9. 在培养皿中加入 10 mL 补充培养基，用无菌剪刀或解剖刀将真皮切成小块，使真皮块小到可以经 10 mL 移液器的开口吸入。
10. 将组织块转移到 50 mL 锥形离心管中。使用另外 10 mL 补充培养基洗涤培养皿，并将洗涤培养基添加到锥形管中。将 10 mL 1,500 U/mL 胶原酶溶液加入含有组织块的试管中（总体积 30 mL）。盖紧试管。
11. 在 37ºC 下孵育试管1小时，每15分钟用力涡旋试管一次。孵育期结束时，组织应几乎完全酶解，且不再可见。如果1小时后仍可看到真皮块，请继续孵育，每15分钟检查一次，直到皮肤块不再可见（不要超过2小时）。
12. 胶原酶酶解结束后，以 180 × g 的设置离心细胞悬液 7–10 分钟。
13. 小心从试管中移除上清液，避免移动沉淀物。使用 1,000 μL 移液器吸头从沉淀物中移除任何剩余的上清液。
14. 向 50 mL 试管中加入 30 mL 补充培养基，并重悬细胞沉淀物（无需获得单细胞悬液）。更换盖子并拧紧。
15. 以 180 × g 的设置再次离心细胞悬液 7–10 分钟。
16. 小心从试管中移除上清液，避免移动沉淀物。使用 1,000 μL 移液器吸头从沉淀物中移除任何剩余的上清液。从管壁内吸出所有残留液滴。
17. 将沉淀物重悬于 3 mL 补充培养基中。
18. 测定浓度（活细胞数/mL）并计算原代培养所需的培养表面积，如下所述。将剩余细胞悬液置于 4ºC 下直至需要使用。
19. 向含有 20 μL 台盼蓝溶液的无菌试管中加入 20 μL 来自步骤17的等份细胞悬液，并使用血细胞计数器测定制备液中的活细胞总数。对于从新生儿组织中分离的真皮细胞，以 5 × 10³ 个活真皮细胞/cm² 进行铺板。
20. 对于 AOF 培养物，请按如下所述使用包被基质包被培养表面。对于含血清的培养基，请继续步骤21。
    
    
    • 获取并标记所需数量的培养瓶。
    • 每 250 cm₂ 待包被表面需要1个包被基质试剂盒。
    • 将一试管 (0.5 mL) 包被基质的内容物添加到一瓶稀释培养基 (50 mL) 中。
    • 为每个要包被的 25 cm₂ 培养瓶加入 5 mL 稀释后的包被基质
    • 彻底涡旋培养瓶以包被每个培养瓶的表面。室温下孵育30分钟。
    • 在真空条件下使用巴斯德吸管从培养瓶中吸出包被基质溶液。
      
      
21. 或者，也可以在细胞铺板之前直接将包被基质添加到细胞悬液中，无需使用稀释培养基。按 1:100 的比例将包被基质稀释到细胞悬液中。
22. 从 4°C 条件中取回细胞悬液。
23. 将细胞悬液稀释到补充培养基中，以得到体积适合所用培养表面且浓度为 5 × 10³ 个活细胞/cm² 的悬液。例如，以体积为 15 mL/瓶且浓度为 2.5 × 10⁴ 个细胞/mL 的细胞悬液接种 T-75 培养瓶
24. 在 37°C 和 5% CO₂ 条件下孵育培养瓶。

原代培养

初次接种原代培养物后，24小时后更换培养基，然后至少每48小时更换一次。培养物融合度达到 >50% 后，应每日更换培养基。培养物融合度达到 ~90%（7–13 天）后，进行传代培养或使用 SAF 冻存培养基冻存细胞，如下文所述。在显微镜下观察培养物以确定培养条件（即融合度、有丝分裂活性）。


真皮成纤维细胞的传代培养

此实验方案旨在对一个 25 cm₂ 培养瓶内接近融合的活跃增殖细胞进行传代培养。如需使用不同尺寸的培养容器，则需对试剂体积进行相应调整。
 
备注： 我们不建议在使用前加热试剂。

1. 从培养瓶中移除所有培养基。
2. 向培养瓶中加入 3 mL 不含 Ca++ 和 Mg++ 的 PBS。摇动培养瓶，确保整个表面已包被。
3. 立即从培养瓶中移除 PBS 溶液，并加入 1 mL TrypLE 溶液。来回摇动培养瓶，确保包被均匀。
4. 室温下孵育培养瓶5分钟。在显微镜下观察培养物。当细胞部分脱附并呈圆形时，轻拍培养瓶，使细胞从培养瓶表面脱离。
5. 向培养瓶中加入 4 mL 完全培养基，并将脱附的细胞转移至一支 15 mL 无菌锥形管中。
6. 向培养瓶中额外加入 4 mL 完全培养基，并使用移液器将溶液在培养瓶表面移液数次，以去除所有剩余的细胞。将此溶液加入 15 mL 锥形管中。
7. 将细胞以 180 × g 的设置离心 7–10 分钟。观察细胞沉淀物。

备注：  在 FABM/dFAS 条件下培养细胞时，可能会观察到稀疏或松散的细胞沉淀物。从细胞沉淀物中吸出培养基时请小心操作。

5. 小心从试管中移除上清液，避免移动细胞沉淀物。
6. 将细胞沉淀物重悬于 4 mL 完全培养基中。用 1 mL 移液器吸头上下吸移细胞，确保细胞悬液均匀。使用血细胞计数器测定悬液中的细胞浓度。
7. 将细胞稀释于补充培养基中，并以 2.5 × 10³ 个细胞/cm_² 的密度接种新培养容器。
8. 在含 5% CO₂/95% 空气的 37°C 加湿细胞培养箱中孵育培养物。

真皮成纤维细胞的冻存

1. 在显微镜下观察培养物以确定培养条件（即融合度、有丝分裂活性）。当培养物融合度达到约 90% 且生长活跃时，我们建议冻存真皮成纤维细胞。

备注：  我们不建议在使用前加热试剂。

2. 按照真皮成纤维细胞传代培养步骤 1–8 进行操作。
3. 将细胞沉淀物重悬于少量低温 (4°C) Synth-a-Freeze® 冻存培养基中，以获得大约 2–5 × 10⁶ 个细胞/mL 的密度。
4. 使用血细胞计数器测定密度（活细胞数量/mL），并稀释到所需的最终细胞密度（建议为 5–10 × 10⁵ 个活细胞/mL）。
5. 采用程控降温仪或其他合适的设备将细胞冻存，然后转移至液氮中储存（气相）。