将神经胶质前体细胞分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞

神经胶质前体细胞 (GPC) 也称为胶质细胞限制祖细胞 (GRP) 或少突胶质细胞前体细胞 (OPC)，有可能分化为少突胶质细胞或星形胶质细胞。GPC 群来源于组织或者通过分化从多能细胞生成，由外源性应用因子诱导。我们在本文中描述了一种经过调整可促进分化为星形胶质细胞或少突胶质细胞的培养系统。

所需材料

细胞

• GIBCO 大鼠神经胶质前体细胞（货号 N7746-100）

培养基和试剂

• Neurobasal 培养基（货号 21103-049）
• D-MEM（货号 11995）
• GlutaMAX-I（货号 35050）
• B-27 无血清补充剂（货号 17504-044）
• N-2 补充剂（货号 17502-048）
• T3（碘塞罗宁）（Sigma，货号 T6397）
• FBS（货号 16000）
• Geltrex 低生长因子基底膜基质（货号 12760）
• 层黏连蛋白（货号 23017）
• 多聚-L-鸟氨酸（Sigma，货号 P4957）
• 蒸馏水（货号 15230）
• KnockOut D-MEM/F-12（货号 12660）
• 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (D-PBS)（货号 14190）
• Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (D-PBS)（货号 14040）
• StemPro NSC SFM（货号 A10509-01）

少突胶质细胞分化培养基使用添加 B-27、GlutaMAX-I 和 T3 的 Neurobasal 培养基。在 2-8°C 下避光储存时，完全培养基可稳定放置 2 周。

要制备 100 mL 的完全培养基，请在无菌条件下混合以下组分。如需使用更大体积，请按比例增加组分用量。

制备星形胶质细胞分化培养基

星形胶质细胞分化培养基使用添加 N-2、GlutaMAX-I 和 FBS 的 D-MEM 培养基。在 2-8°C 下避光储存时，完全培养基可稳定放置 2 周。

用于少突胶质细胞分化的基质

1. 在蒸馏水中以 1:500 的比例制备多聚-L-鸟氨酸稀释液，使得最终浓度为 20 μg/mL。
2. 向 35 mm 培养皿中加入 2 mL 20 μg/mL 多聚-L-鸟氨酸溶液（4 孔板或玻片：0.5 mL，8 孔玻片：0.25 mL）。
3. 在 37°C、含 5% CO₂ 的湿润环境中孵育培养容器至少 1 小时。
4. 用蒸馏水冲洗培养容器一次。
5. 在蒸馏水中以 1:1,000 的比例制备层黏连蛋白稀释液，使得最终浓度为 1 μg/mL。
6. 向 35 mm 培养皿中加入 2 mL 1 μg/mL 层黏连蛋白溶液（4 孔板或玻片：0.5 mL，8 孔玻片：0.25 mL）。
7. 在 37°C、含 5% CO₂ 的湿润环境中孵育培养容器至少 1 小时。使用前在 4°C 下储存。   

注：您可以提前包被平板并将它们储存于 2-8°C 下，使用 Parafilm 紧密包裹储存长达 4 周。

用于星形胶质细胞分化的基质

1. 在 4°C 下过夜解冻 Geltrex 瓶，以防止聚合。第二天，通过使用 D-MEM/F-12 稀释至最终浓度为 10 mg/mL，制备 Geltrex 的 50X 储备液。使用冰盒将瓶放置在 4°C 下。在 50 mL 锥形管（在冰上预冷）中快速制备 1 mL 等份试液，并将其储存于 -20°C 下。
2. 在 4°C 下缓慢解冻 1 管 Geltrex（上述 1 mL 等份试液），并添加 49 mL 低温 D-MEM/F-12。轻轻混匀。
3. 使用 Geltrex 溶液覆盖各培养板的整个表面（35 mm 培养皿：1.5 mL，60 mm 培养皿：3 mL，T-25 培养瓶：5 mL）。
4. 使用 Parafilm 密封每一个培养皿以防止干燥，于室温条件下在层流净化罩中孵育 1 小时。使用前在 4°C 下储存。
5. 临使用前，去除所有的 Geltrex 溶液，使用含钙和镁的 D-PBS 洗涤一次，并将其替换为预热的完全培养基。

注：您可在 2-8°C 下储存 Geltrex 处理过的培养皿，使用 Parafilm 紧密包裹储存长达 1 个月。请确保平板不会变干。请在临使用前去除 Geltrex 溶液。

分化为少突胶质细胞

1. 在 StemPro NSC SFM 中，将神经胶质前体细胞铺至多聚-L-鸟氨酸和层黏连蛋白包被板上，铺板密度为 2.5 × 10⁴-5 × 10⁴ 个细胞/cm²。
2. 培养细胞 2 天，然后将培养基更换为少突胶质细胞分化培养基。
3. 每 3-4 天更换一次培养基。

分化为星形胶质细胞

1. 在 StemPro NSC SFM 中，将神经胶质前体细胞铺至 Geltrex 包被板上，铺板密度为 2.5 × 10⁴ 个细胞/cm²。
2. 培养细胞 2 天，然后将培养基更换为星形胶质细胞分化培养基。
3. 每 3-4 天更换一次培养基。