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相关产品信息

介绍

描述

TRIzol Plus RNA 纯化试剂盒提供了一种简单、可靠且快速的方法，可从多种样品（包括动物和植物细胞和组织、细菌以及酵母菌）中分离高质量的总 RNA。该试剂盒利用了 TRIzol 试剂的强裂解能力和 PureLink™ RNA 小提试剂盒的便利且省时的硅胶柱纯化方案，可在一小时内纯化超纯总 RNA，即使困难样品（如纤维组织）也是如此。TRIzol 试剂是一种苯酚、异硫氰酸胍和其他专有组分的单相溶液，有助于分离各种大分子或小分子量的 RNA。TRIzol 试剂可保持 RNA 完整性，同时破坏细胞并溶解细胞组分，还可在样品均质化或裂解过程中对 RNase 活性进行即时高效抑制。

将 TRIzol 试剂和 RNA 柱纯化相结合是基因表达行业中的推荐 RNA 纯化方法。TRIzol Plus RNA 纯化试剂盒提供试剂和优化方案，使用行业推荐方法纯化总 RNA 以进行基因表达研究。

系统概述

使用 TRIzol Plus RNA 纯化试剂盒从样品中分离纯化 RNA ，首先使用 TRIzol 试剂，根据提供的裂解物制备方案对您的样品进行裂解。向您的样品中加入氯仿或者BCP，在离心操作后，可将溶液分离成含有 RNA 的上层水相和含酚的下层有机相。将上层水相被移到新试管中，然后再添加乙醇并离心。然后将样品转移至含有透明硅胶膜的 PureLink™ RNA 小提试剂盒离心纯化柱中， RNA 会在纯化过程中与之结合。这种 RNA 经洗涤以去除污染物，而纯化的总 RNA 在无 RNase 水 (也可使用 pH 值 7.5 的 Tris 缓冲液) 中洗提，就可适用于多种下游应用，包括敏感基因表达研究，例如微阵列分析或实时定量 RT-PCR (qRT-PCR)。

PureLink® RNA 小提试剂盒规格

柱结合量：约 1mg 核酸
装柱器量：700 μl
清洗管容量：2.0 ml
离心机兼容性：能够离心 >12,000 × g
洗脱体积：30 μl–3 × 100 μl (3 次连续洗脱，各 100 μ)

注

  • 本页提供了使用 TRIzol 试剂从样品中纯化总 RNA 制备裂解物并在相分离后使用 PureLink™ RNA 小提试剂盒纯化纯化 RNA 的说明 。如果您想要使用其他 RNA 纯化方案，请参阅 TRIzol 试剂手册 或 PureLink™ RNA 小提试剂盒手册。
  • TRIzol Plus RNA 纯化试剂盒使用 TRIzol 试剂进行样品裂解。  本方案不使用试剂盒附带的裂解缓冲液。但如果您想要使用裂解缓冲液制备样品，请参阅 PureLink™ RNA 小提试剂盒手册。
  • 如果您的下游应用需要无 DNA 的总 RNA， PureLink™ DNase 小提试剂盒手册中提供了 RNA 纯化过程中或纯化后的柱上 进样 PureLink™ RNA 处理方案。


注意

  • TRIzol 试剂含有苯酚 (有毒且具腐蚀性) 和异硫氰酸胍 (刺激物) ，如果处理不当，可能会对健康造成危害。避免与 TRIzol 试剂直接接触，因为皮肤、眼睛或呼吸道与 TRIzol 试剂直接接触可能会导致暴露区域的化学灼伤。请在通风橱中使用 TRIzol 试剂。请参阅 TRIzol 试剂产品插页，了解更多详情。联系您的环境卫生和安全 (EH&S) 部门，获取正确的工作和处置指南。
  • 裂解缓冲液和洗涤缓冲液 I 均含有异硫氰酸胍 (一种刺激物)。
  • 这种化学品接触皮肤或吸入或摄入时均有害。由于形成反应性复合物和有毒气体，请勿直接将漂白剂或酸性溶液添加到含有异硫氰酸胍的溶液或样品制备废弃物中。含乙醇的溶液视同易燃物。使用该化学品时请采取适当的预防措施。
  • 为确保您的防护，处理这些化学品时始终穿戴实验室工作服、手套和护目镜。将缓冲液和化学品弃置在适当的废弃物容器中。



使用指南

  • PureLink™ RNA 小提试剂盒离心柱的最大 RNA 结合量约为 1 mg。如果您处理的样品包含超过 1 mg 的总 RNA ，将该样品分为等份试液，使得每个等份试液包含 <1 mg 总 RNA，供每个离心柱使用。
  • 使用一次性、独立包装的无菌塑料器具和无菌的、一次性无 RNase 移液器吸头和试管。
  • 在处理试剂和 RNA 样品时戴一次性手套，以防止皮肤表面的 RNase 污染；频繁更换手套，特别是随着实验方案从粗提取物进展为纯化度更高的材料。
  • 使用 RNA 时，请务必使用适当的微生物学无菌操作。
  • 在处理 <2 mL 体积的 TRIzol 试剂时，使用透明一次性聚丙烯试管。对于更大体积的试管，使用玻璃 (Corex) 或聚丙烯试管，并确保试管能够耐受使用 TRIzol 试剂和氯仿在 12,000 × g 下离心。请勿使用泄漏或开裂的试管。
  • 使用 RNase AWAY 试剂 (目录号 10328-011) 去除纯化过程中所用工作台面及离心机和移液器等非一次性物品所致的 RNase 污染。

需要的材料

  • 起始材料 (新鲜或冷冻组织，或细胞)
  • TRIzol 试剂和 PureLink™ RNA 小提试剂盒 (随附)
  • 氯仿或 4-溴苯甲醚
  • 96-100% 乙醇和 70% 乙醇 (溶于无 RNase 水)
  • 微量离心机能够在 12,000 × g 下进行离心
  • 均质器（目录号：12183 – 026) 或 Rotor-Staator 均质器
  • 1.5 ml 无 RNase 微量离心管和无 RNase 移液器吸头

订购信息

货号 产品名称 规格 单价 (CNY) 数量
12183555 TRIzol™ Plus RNA Purification Kit Each
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实验方案

使用乙醇制备洗涤缓冲液 II

在开始裂解前，向洗涤缓冲液 II 中加入 60 ml 96-100% 乙醇勾选洗涤缓冲液 II 标签上的方框，表示添加了乙醇。将含乙醇的洗涤缓冲液 II 储存在室温下。

使用 TRIzol 试剂制备裂解物

使用 TRIzol 试剂从如下所述各种样品类型中制备裂解物。使用组织均质器或 Rotor-stator 均质器，按照每 50 – 100 mg 组织 1 ml TRIzol 试剂对组织样品进行均质化。样品体积不应超过用于均质化的 TRIzol 试剂体积的 10%。

贴壁细胞：

通过向培养皿中加入 1 mL TRIzol 试剂并使用移液吸头多次吸取和排出细胞，从而将这些细胞直接裂解在培养皿中。所需 TRIzol 试剂的量基于培养皿面积 (1 m  /10 cm2) ，而不是存在的细胞数量。

悬浮细胞：

通过离心收获细胞和沉淀细胞。每 5 – 10 × 10 6 个动物、植物或酵母细胞、或 1 × 10 7 个细菌细胞使用 1 ml TRIzol 试剂。通过用移液吸头重复吸取和排出细胞来将其裂解。在添加 TRIzol 试剂前不要洗涤细胞，以避免任何 mRNA 降解。破坏某些酵母和细菌细胞可能需要均质器。

相分离

在细胞或组织裂解后 (如上) ，执行以下步骤以分离 RNA。

  1. 将裂解物与 TRIzol 试剂 (如上) 在室温下孵育 5 分钟，以实现核蛋白复合物的完全解离。

  2. 每 1 ml TRIzol 试剂加入 0.2 μL ml 氯仿或 50 μ l 4-溴苯甲醚。用力手摇试管 15 秒钟。备注：涡旋可能会增加 RNA 样品的 DNA 污染。如果下游应用对 DNA 敏感，或者在 RNA 纯化过程或纯化后执行 DNase 消化步骤，请避免涡旋 ，请参阅 PureLink™ RNA 小提试剂盒手册。

  3. 室温孵育 2–3 分钟。

  4. 在 4°C 下以 12,000 × g 离心样品 15 分钟注意：离心后，混合物分离成  一个红色的下层有机相（苯酚-氯仿）、一个中间相和一个无色的上层水相（其中含 RNA）。水相约为 600 μL。

  5. 将约 400 μL 的无色上层相（含 RNA）转移到新鲜的无 RNase 试管中。

  6. 添加等体积的 70% 乙醇，以获得 35% 的最终乙醇浓度。通过涡旋充分混匀。

  7. 上下颠倒试管，使在加入乙醇后可能形成的任何可见沉淀物分散。

  8. 如下继续结合、洗涤和洗脱。

结合、洗涤和洗脱

按照以下步骤从样品中结合、洗涤和洗脱 RNA。

  1. 将多达 700 μL 的样品 (按上述制备) 转移到离心纯化柱 (带一个收集管) 中。

  2. 室温下 12,000 × g 离心 15 秒。丢弃液体，然后将离心纯化柱重新插入同一收集管。

  3. 重复步骤 1-2，直到已处理整个样品。可选：如果您的下游应用需要不含 DNA 的总 RNA ，请立即在 RNA 纯化过程中进行柱上进样 PureLink™ DNase 处理 ( 有关详细信息，请参阅 PureLink™ RNA 小提试剂盒手册 ）。

  4. 向离心纯化柱加入 700 μL 洗涤缓冲液 I。室温下 12,000 × g 离心 15 秒。丢弃流穿液和收集管。将离心柱插入新的采集管中。

  5. 向离心纯化柱加入 500 μL 含乙醇的洗涤缓冲液 II (上一页)。

  6. 室温下 12,000 × g 离心 15 秒。丢弃流过物，然后将离心纯化柱重新插入同一收集管。

  7. 重复步骤 5–6 一次。

  8. 在室温下以 12,000 × g 离心纯化柱和收集管 1 分钟，以干燥吸附有 RNA 的膜。丢弃收集管，然后将离心纯化柱插入回收管。

  9. 向离心纯化柱中心加入 30 μL –3 × 100 μL（3 种连续洗脱液，各 100 μL）不含 RNase 的水 ( 有关更多详细信息，请参阅 PureLink™ RNA 小提试剂盒手册）。

  10. 室温孵育 1 分钟。

  11. 在室温下，以 ≥12,000 × g 将纯化柱与回收管离心 2 分钟。备注：  如果您执行顺序洗脱，请将所有洗脱液收集到同一个试管中。

纯化 RNA 的储存和下游应用

如果您将在几小时内使用纯化的 RNA ，请将其用干冰储存。如需长期储存，请在– 80°C 下储存纯化的 RNA

您可以将纯化的总 RNA 用于 qRT-PCR、Northern 印迹、核酸酶保护试验、微阵列分析的 RNA 扩增、或任何所需的下游应用。

如果需要不存在基因组 DNA 污染的高纯度 RNA，请在纯化后进行 DNase I 处理 ( 有关详细信息，请参阅 PureLink™ RNA 小提试剂盒手册 ）。要测定纯化的品质和数量，可以采用紫外吸光度 (260 nm)，也可以采用 Quant-iT™ RNA 检测分析试剂盒（目录号： Q33140）。

辅助产品

我们提供用于 RT-PCR、qRT-PCR、微阵列分析以及逆转录的大量产品。有关更多信息， 请访问我们的网站 或致电技术支持部门。


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问题排查

问题 原因 溶液
RNA 产量低裂解和均质化不完整
  • 根据上述起始材料，使用适当的裂解物制备方法。
  • 减少所使用起始材料的数量。
  • 将组织样品切割成小块，并确保组织完全浸入 TRIzol 试剂中，以实现最佳裂解。
 样本质量差
  • 分离的 RNA 产量和质量取决于起始材料的类型和老化。
  • 使用新鲜样品并在收集后立即并进行处理，或在收获后立即将样品冻存在 -80°C 或液氮中。
 RNA 离心纯化柱堵塞清除匀浆并通过离心去除任何颗粒或粘性材料，仅将上清液用于后续加载到离心纯化柱上。
 未向洗涤缓冲液 II 中添加乙醇使用前向洗涤缓冲液 II 中加入乙醇。
 洗脱条件不正确添加无 RNase 水 (30–3 ×100 μl) ，在离心前孵育 1 分钟。要回收更多 RNA ，请务必使用最多 3 次连续洗脱，每次洗脱 100 μl (3 × 100 μl) 洗脱缓冲液 (请参阅洗脱方案)。
RNA 已降解RNA 被 RNase 污染请遵循以上指南，以防止 RNase 污染。
 从收获到裂解过程中样品处理不正确如果组织样本在收获后没有立即进行处理，请在收获后立即快速冷冻组织，并冻存在 -80°C 或液氮中。将样品保持冷冻，直至加入 TRIzol 试剂。添加 TRIzol 试剂后快速进行裂解。
抑制下游酶促反应纯化 RNA 中存在乙醇洗涤缓冲液 II 中有痕量乙醇可抑制下游酶促反应。丢弃洗涤缓冲液 II 的流穿液。将离心纯化柱放入回收管中，以 12,000 × g 离心 1-2 分钟让纯化柱完全干燥
 纯化 RNA 中存在盐使用合适的洗涤缓冲液顺序进行洗涤。始终使用洗涤缓冲液 I 洗涤，然后用洗涤缓冲液 II 洗涤
Low A260/A280 比率偏低样品经水稀释使用 10 mM Tris-HCl (pH 值 7.5) 稀释样品进行 OD 测量。
25-0915   版本 C    2008 年 6 月 11 日