生物素结合剂 – 去除或阳性分离不同物种的细胞

Dynabeads 生物素结合剂与生物素化抗体相结合，非常适用于去除或阳性分离任何物种的细胞，具体取决于抗体的特异性。根据靶标的不同，也可使用其他生物素化分子（如多肽/蛋白、凝集素、核酸）。可直接分离任何样本（如全血、骨髓、单核细胞悬浮液或组织消化物）中的细胞。

备注： 如果您希望通过生物素化抗体 + 微珠分离的方式进行阳性细胞分离，请使用 CELLection™ 生物素结合剂（货号 161.02）。如果您要将生物素化配体用于分子应用，如蛋白纯化、DNA/RNA 结合蛋白分离、制备单链模板等，请访问 www.lifetechnologies.com 以了解其他链霉亲和素包被微珠。

分离原理

在分离细胞前，将生物素化抗体添加到细胞样本中（间接技术）或预包被到微珠上（直接技术）。在试管中混合 Dynabeads 与细胞样本。Dynabeads 将在短暂的孵育过程中结合靶细胞，然后用磁铁分离微珠结合细胞。

• 阳性分离 - 丢弃上清液并将微珠结合细胞用于下游应用。
• 去除 - 丢弃微珠结合细胞并将剩余的未接触细胞用于任何应用。

材料描述

Dynabeads 生物素结合剂是均匀的超顺磁性聚苯乙烯微珠（直径 2.8 μm），包被了重组链霉亲和素。包被在 Dynabeads 上的链霉亲和素将结合大多数生物素化配体。重组链霉亲和素既不含糖，也不含 RYD 序列，因此可避免细胞与链霉亲和素通过凝集素样受体或其他黏附受体进行不必要的结合。

提供的材料

5 mL Dynabeads 生物素结合剂，以 pH 7.4、含 0.1% BSA 和 0.02% 叠氮化钠 (NaN₃) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供，浓度为 4 x 10⁸ 个微珠/mL。本产品将处理多达 2 x 10⁹ 个细胞。

所需的其他材料

• 生物素化配体（如抗体、多肽/蛋白、凝集素或核酸）。
• 磁铁 (Dynal MPC™)：  有关磁铁建议，请访问 www.lifetechnologies.com/magnets-selection。
• 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
• 缓冲液1：含 0.1% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS，pH 7.4。

重要提示：

血清或血清白蛋白组分可能含有游离生物素，因此不可使用。Dynal 建议使用 Sigma 的牛血清白蛋白组分 V（货号 A4503 或等效产品），其不含游离生物素。请勿使用培养基，因为其可能含有游离生物素。BSA 可用其他无生物素的封闭蛋白或 1 mg/mL 普朗尼克 (F68) 代替。EDTA 可用柠檬酸钠代替。不建议使用含 Ca²⁺ 或 Mg²⁺ 的 PBS。

Dynabeads 洗涤程序

使用前，应先洗涤 Dynabeads。

1. 在小瓶中重悬 Dynabeads。


2. 将所需体积的 Dynabeads 转移至试管中。


3. 加入相同体积或至少 1 mL 的缓冲液1并混合。


4. 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。


5. 从磁铁中取出试管，在体积与 Dynabeads 初始体积（第2步）相同的缓冲液1中重悬洗过的 Dynabeads。

样本制备

全血和血沉棕黄层

使用前，可以洗涤全血和血沉棕黄层以去除干扰因素。

  1.   在缓冲液1中稀释全血或血沉棕黄层 (1+2)。

  2.   在室温 (18-25°C) 下以 600 x g 的速度离心10分钟。

  3.   丢弃血浆部分/上层。

  4.   在缓冲液1中重悬至原始体积 (2-8°C)。

从全血、血沉棕黄层或骨髓制备 MNC

  1.   以 1 x 10⁷ 个细胞/mL 的浓度在缓冲液1 (2-8°C) 中重悬细胞。

如需推荐的人和小鼠样本制备程序列表，请联系技术中心。

细胞分离的关键步骤

使用可以倾斜和旋转试管的混合器，确保 Dynabeads 不会沉淀在管底。孵育 Dynabeads 和细胞时，孵育温度必须介于 2-8°C 之间，以减少吞噬活性和其他代谢过程。对于每 mL 细胞样本，切勿使用少于 25 μL (1 x 10⁷) Dynabeads，每个靶细胞应至少对应4个 Dynabeads。

表1：每 mL 细胞样本添加的 Dynabeads 体积。可以根据需要增加体积。

* 如果细胞浓度增加或靶细胞浓度超过 2.5 x 10⁶，必须相应增加 Dynabeads 体积。细胞浓度可高达 1 x 10⁸ 个细胞/mL。

细胞分离 – 间接技术

使用生物素化抗体或配体标记细胞

根据制造商的建议使用生物素化抗体标记细胞。如有必要，优化孵育时间、抗体滴度和细胞浓度，以获得最佳信噪比。使用约 1 μg 生物素化抗体/10⁶ 个靶细胞（如未提供其他建议）和 ≥ 1 x 10⁷ 个细胞/mL。

1. 向细胞悬液中加入一抗并混合。


2. 在 2-8°C 下孵育10分钟。


3. 每 1 x 10⁷ 个细胞加入 2 mL 缓冲液1来洗涤细胞，然后以 300 x g 的速度离心8分钟。丢弃上清液。


4. 以 1 x 10⁷ 个细胞/mL 的浓度在缓冲液1中重悬细胞。


5. 继续分离或去除细胞。

分离或去除细胞

1. 根据表1向制备的样本中添加 Dynabeads。


2. 在 2-8°C 下孵育20分钟（阳性分离）或30分钟（去除），同时轻轻倾斜和旋转试管。


3. 可选：使用双倍体积的缓冲液1，以减少未结合细胞的滞留。


4. 将试管放入磁铁3分钟。


5. 去除：将含有未结合细胞的上清液转移到新试管中，供进一步实验使用。


6. 阳性分离：使用下列程序丢弃上清液并轻轻洗涤微珠结合细胞4次：

            i).每 1 x 10⁷ 个 Dynabeads 添加 1 mL 缓冲液1。

            ii). 将试管放入磁铁2分钟并丢弃上清液。



7. 在缓冲液/培养基中重悬细胞以用于下游应用。

细胞分离 – 直接技术

预包被 Dynabeads

• 每 25 μL (1 x 10⁷) Dynabeads 使用 0.5-1.5 μg 生物素化抗体。建议用滴定法测量抗体量。

1. 将洗过的 Dynabeads 转移到试管中。


2. 加入生物素化抗体。


3. 孵育 > 30 分钟，同时轻轻倾斜和旋转试管。


4. 将试管放入磁铁2分钟并丢弃上清液。


5. 使用 2 mL 缓冲液1洗涤微珠两次。


6. 从磁铁中取出试管，在体积与 Dynabeads 初始体积相同的缓冲液1中重悬洗过的 Dynabeads。

分离或去除靶细胞

1. 根据表1向细胞中加入预包被的 Dynabeads。


2. 在 2-8°C 下孵育20分钟（阳性分离）或30分钟（去除），同时轻轻倾斜和旋转试管。


3. 可选：使用双倍体积的缓冲液1，以减少未结合细胞的滞留。


4. 将试管放入磁铁3分钟。


5. 去除：将含有未结合细胞的上清液转移到新试管中，供进一步实验使用。


6. 阳性分离：使用下列程序丢弃上清液并轻轻洗涤微珠结合细胞4次：
   
   

            i).每 1 x 10⁷ 个 Dynabeads 添加 1 mL 缓冲液1。

            ii). 将试管放入磁铁2分钟并丢弃上清液。

  7.   在缓冲液/培养基中重悬细胞以用于下游应用。

直接技术与间接技术的比较

在以下情况下，请使用间接技术：

• 使用了生物素化抗体的混合物。
• 需要非常高的去除效率。
• 生物素化单克隆抗体的亲和力较低。
• 细胞表达少量靶抗原。
• 直接技术带来的纯度不能令人满意。

在以下情况下，可以使用直接技术：

• 生物素化抗体的亲和力较高。
• 细胞表达大量靶抗原。
• 预包被 Dynabeads 需要备料。

抗体选择

生物素化抗体的选择是成功分离细胞的最重要因素。请注意，尽管一些抗体在其他免疫学检测中获得了不错的结果，但包被到微珠上时（直接技术），这些抗体的抗原结合效率可能降低。一些抗体可能会以含有较多游离生物素的缓冲液的形式提供。为了能够预包被 Dynabeads（直接技术），需要去除游离生物素（例如，截断分子量为10,000的透析或离心柱）。

使用生物素化抗体标记细胞

• 为避免非特异性结合细胞（例如单核细胞、B 细胞），在加入生物素化抗体前，先加入聚集 IgG 以阻断 Fc 受体。
• 分离细胞前，必须通过洗涤去除过量的抗体。

分离和去除靶细胞

• 去除密度梯度培养基（例如，Ficoll）：在加入生物素化抗体或 Dynabeads 前洗涤细胞。
• 去除血清中的可溶性因子：血清可能含有可溶性因子（例如抗体、细胞表面抗原），它们会干扰细胞分离方案。洗涤细胞一次可以减少这种干扰。