富集未接触的小鼠树突状细胞

使用本产品，通过去除小鼠脾脏或淋巴结细胞中的 T 细胞、mIgM⁺ B 细胞、NK 细胞、红细胞和大多数粒细胞来富集未接触的小鼠树突状细胞 (DC)。富含 DC 的细胞群无微珠和抗体，适合通过流式分选进一步分离任何 DC 亚群。

在富集的细胞群中，DC 的特征是表达 CD11c 并且没有谱系标记物，这有别于那些共浆细胞样 DC。本试剂盒能以较高的回收率回收 CD11c⁺ 细胞，适用于通过 FACS 进一步富集任何亚群，包括对 CD4、CD8a、B220 和 CD19 呈阳性的 DC (1-4)。

分离原理

向起始样本中加入抗非 DC 细胞的生物素化单克隆抗体混合物。加入 Depletion MyOne™ SA Dynabeads，让它们在短暂的孵育过程中结合非 DC。用磁铁分离微珠结合细胞。丢弃微珠结合细胞并使用剩余的未接触富集细胞群进行进一步流式分选，以获得感兴趣的 DC 亚群

材料描述

提供的材料

• 5 mL Depletion MyOne SA Dynabeads  --  Depletion MyOne SA Dynabeads 是均匀的超顺磁性聚苯乙烯微珠（直径 1.0 μm），包被了链霉亲和素 (SA)。以 pH 7.4、含 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.02% 叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供，浓度为 10 mg 微珠/mL。

• 用于小鼠 DC 试剂盒的 1 mL 抗体混合物  --  抗体混合物含有抗小鼠 CD2、CD3ε、CD49b、mIgM 和 Ter-119 的生物素化单克隆抗体的优化混合物，以 pH 7.4、含 0.02% 叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供。

• 试剂盒将处理大约 4 x 10⁹ 个白细胞（对应 5 x 10⁸ 个密度梯度法制备的白细胞）。

所需的其他材料

• 磁铁 (Dynal MPC™)：请参阅磁铁建议。
• 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
• 缓冲液1：含 0.1% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺），pH 7.4。
• 缓冲液2：含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 以及 0.1% BSA 的 PBS，pH 7.4
• DNase
• 0.5M EDTA
• 密度梯度培养基 –（例如 Nycodenz 1.077 g/cm³ 或等效产品）
• 细胞滤网，70 μm

重要提示：

• 在富集步骤中，务必让缓冲液保持低温 (2-8˚C)。
• 不建议使用含 Ca²⁺ 或 Mg²⁺ 的 PBS，除非 DNase 处理时需要使用（按方案规定）。
• 请勿使用含生物素的缓冲液或添加剂（如 FCS），因为这可能会降低去除效率。
• 使用可以倾斜和旋转试管的混合器，确保 Dynabeads 不会沉淀在管底。
• 请遵循磁铁建议，确保成功分离。

1. 在小瓶中重悬 Dynabeads。


2. 将所需体积的 Dynabeads 转移至试管中。


3. 加入相同体积或至少 1 mL 的缓冲液1并混合。


4. 将试管放入磁铁3分钟并丢弃上清液。


5. 从磁铁中取出试管，在体积与 Dynabeads 初始体积（第2步）相同的缓冲液1中重悬洗过的 Dynabeads。

• 此方案的基础是从最多5个脾脏中分离。
  
  

1. 从近期杀死的小鼠体内取出脾脏或淋巴结，然后转移到一支 50 mL 试管中，试管装有 30 mL 添加了 120 IU/mL DNAse 且已调至室温的缓冲液2。


2. 通过 70 μm 细胞滤网将组织压入新试管中。用初始缓冲液冲洗细胞滤网，以冲掉所有细胞。


3. 在室温 (RT) 下，以倾斜、旋转的方式孵育试管15分钟。


4. 向每支试管中加入 0.2 mL 0.5 M EDTA 以溶解任何 DC-T 细胞团块。


5. 混匀，然后置于滚轮上在室温下以倾斜、旋转的方式孵育5分钟。在冰上使用低温缓冲液进行进一步细胞处理。


6. 使用一张新的 70 μm 细胞滤网将细胞过滤到新的 50 mL 试管中，然后使用缓冲液1冲洗滤网。


7. 向试管中加入缓冲液1。


8. 在 2-8°C 下以 300 x g 的速度离心10分钟。


9. 丢弃上清液并在 5 mL 缓冲液1中重悬细胞团块。


10. 将细胞悬液和细胞层小心转移到 15 mL 试管中的 4 mL 密度梯度培养基上。


11. 在 2-8°C 下以 1700 x g 的速度离心10分钟，缓慢加速且不使用制动器。


12. 小心地将白细胞层转移到新试管中。


13. 向试管中加入缓冲液1。


14. 在 2-8°C 下以 300 x g 的速度离心10分钟。


15. 对细胞计数并在缓冲液1中重悬至 1 x 10⁸ 个细胞/mL 的浓度。

1. 将缓冲液1中的 100 μL (1 x 10⁷) 白细胞转移到试管中。


2. 加入 20 μL 抗体混合物。


3. 混合均匀并在 2-8°C 下孵育20分钟。


4. 加入 2 mL 缓冲液1来洗涤细胞。倾斜试管几次以混合均匀，并在 2-8°C 下以 300 x g 的速度离心10分钟。丢弃上清液。


5. 在 900 μL 缓冲液1中重悬细胞。


6. 加入 100 μL 经过预洗涤的 Depletion MyOne SA Dynabeads。


7. 在 2-8°C 下孵育15分钟，同时轻轻倾斜和旋转试管。


8. 通过充分吹打或旋晃5秒来重悬微珠结合细胞。


9. 加入 1 mL 缓冲液1。


10. 将试管放入磁铁3分钟。


11. 将上清液转移到新试管中。上清液含有富含 DC 的细胞群。

Invitrogen Dynal AS 符合质量体系标准 ISO 9001:2000 和 ISO 13485:2003。

材料描述

Dynabeads FlowComp™ 是均匀的超顺磁性微珠（直径 2.8 μm）。以 pH 7.4、含 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.02% 叠氮化钠 (NaN₃)（作为防腐剂）的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供，浓度约为 1 × 10⁹ 个微珠 (10 mg)/mL。

储存/稳定性

如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下，在标签上注明的失效日期前，本产品可一直保持稳定。请在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并避免细菌污染。在储存期间和所有操作步骤中，始终让 Dynabeads 处于悬浮液中，因为干燥会导致性能降低。使用前，请充分重悬。

警告和限制

本产品仅用于研究目的。除非另有说明，否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。本产品含有 0.02% 叠氮化钠（作为防腐剂，具有细胞毒性）。

不要用嘴吹打！

叠氮化钠可与铅和铜管发生反应，形成极易爆炸的金属叠氮化物。通过管道排放进行处置时，请用大量水冲洗，以防止叠氮化物积聚。分析证书 (CoA) 可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在 获得。

1. Shortman K and Liu Y (2002) Mouse and human dendritic cell subtypes.Nature Rev. Imm.2:151-161.


2. Henri S et al (2001) The dendritic cell populations of mouse lymph nodes.J. Imm.167: 741-48.


3. Vremec D et al (2000) CD4 and CD8 expression by dendritic cell subtypes in mouse thymus and spleen.J. Imm.164: 2978-86.


4. Baban B et al (2005) A minor population of splenic dendritic cells expressing CD19 mediates IDO-dependent T cell suppression via type I IFN signaling following B7 ligation.Int. Imm.17(7): 909-19.