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Gibco ExpiCHO 表达系统汇集了高表达 CHO 细胞系和优化的培养基以及转染试剂盒，协同作用之下可提供较 Gibco FreeStyle MAX CHO 表达系统和 Gibco Expi293 表达系统更高的滴度，分别是二者的160倍和4倍。与其他瞬时表达技术相比，ExpiCHO 表达系统的超高产量（一些蛋白可达 1-3 g/L）使您能够缩小表达批次规模，显著节约成本。

在此，我们介绍了缩小至以下系统规模的方案：

在96深孔板中进行转染

材料

  • Axygen™ 96深孔圆底储存微孔板（Corning，货号 PDW20CS）
  • AeraSeal™ 无菌微孔板粘合密封膜（E&K Scientific，货号 T896100-S）

    备注：  本方案要求使用定轨摇床；线性微孔板摇床提供的混合程度不足以支持本表达方案。

常规传代培养

  1. 根据 ExpiCHO 试剂盒方案，传代培养并扩增 ExpiCHO-S 细胞，直至细胞密度达到约 4-6 x 106 个活细胞/mL。

第 -1 天：分流细胞

  1. 转染前一天（第 -1 天），根据 ExpiCHO 试剂盒方案，分流 ExpiCHO-S 细胞使最终密度达到 3-4 x 106 个活细胞/mL，并让细胞过夜生长。

第0天：转染

  1. 根据 ExpiCHO 试剂盒方案，使用新鲜的 ExpiCHO 表达培养基将细胞稀释至 6 x 106 个活细胞/mL。
  2. 向96深孔板 (96DWB) 的各孔中分装 0.8 mL 细胞，用于转染。

    备注：在 96DWB 中，外缘各孔的蒸发程度可能高于内部的60个孔。为达到最佳的孔间一致性，我们建议仅使用内部60个孔，并向深孔板外部各孔中分别加入 1 mL PBS，以尽量减少蒸发的可能性。

  3. 制备 ExpiFectamine CHO 试剂-DNA 复合物。

    备注：以下示例用量将得到足以转染4个孔的复合反应体系。对于其他孔数的转染，可按比例缩放用量。 

    • 对于无菌96孔聚丙烯板，通过取 2.5 µL 质粒 DNA（假设储备液浓度为 1 mg/mL）加入 250 µL Gibco OptiPRO SFM 中，稀释质粒 DNA，并使用移液器轻轻上下吹吸 3-4 次混匀。
    • 向稀释后的 DNA 中加入 10 µL ExpiFectamine CHO 试剂，并使用移液器轻轻上下吹吸 3-4 次混匀。
       
  4. 在 96DWB 中，向含有培养物的各孔中加入 65 µL 复合混合物，并使用移液器轻轻上下吹吸 3-4 次混匀。

    • 当加至步骤4所得的 0.8 mL 培养物中时，得到的质粒 DNA 终浓度约为 0.8 µg/mL。该步骤的最终质粒 DNA 浓度为 0.6-0.8 µg/mL，是大多数蛋白生产的典型浓度。
  1. 用透气密封膜盖住培养板。
  2. 将 96DWB 置于 37℃、含 8% CO2 的加湿培养箱中的定轨摇床上（对于定轨直径为 3 mm 的摇床，推荐振荡速度为 900 rpm）孵育。 

第1天：添加增强剂和补料

  1. 转染后第 18-22 小时，加入 ExpiFectamine CHO 增强剂和 ExpiCHO 补料。

    备注：所有用量均可按比例缩放。

    标准方案：对于 96DWB 内部的60个孔，在锥形管中混合 325 µL ExpiFectamine CHO 增强剂和 13 mL ExpiCHO 补料。向 96DWB 的各孔中分别加入 200 µL 该混合物。将 96DWB 放回含 8% CO2 的 37℃ 培养箱中，振摇孵育。

    高滴度方案：对于 96DWB 内部的60个孔，在锥形管中混合 325 µL ExpiFectamine CHO 增强剂和 13 mL ExpiCHO 补料。向 96DWB 的各孔中分别加入 200 µL 该混合物。将 96DWB 转移至含 5% CO2 的 32℃ 培养箱中，振摇孵育。

第 7-10 天：收获上清液

  1. 由于蒸发，建议在转染后的以下天数收获上清液：

    标准方案：转染后第 7-8 天收获上清液。

    高滴度方案：转染后第 7-10 天收获上清液。

    使用两种方案获得的人 IgG 表达结果见图1。
标准方案和高滴度方案的产量图

图1.使用摇瓶或 96DWB 获得的人 IgG 表达结果比较。

在24深孔板中进行转染

材料

  • Axygen™ 24深孔矩形底储存微孔板（Corning，货号 PDW10ML24CS）
  • AeraSeal™ 无菌微孔板粘合密封膜（E&K Scientific，货号 T896100-S）

    备注：本方案中的振荡速度适用于定轨直径为 19 mm 的摇床。对于其他定轨直径的摇床，可能需要调整振荡速度。

常规传代培养

  1. 根据 ExpiCHO 试剂盒方案，传代培养并扩增 ExpiCHO-S 细胞，直至细胞密度达到约 4-6 x 106 个活细胞/mL。

第 -1 天：分流细胞

  1. 转染前一天（第 -1 天），根据 ExpiCHO 试剂盒方案，分流 ExpiCHO-S 细胞使最终密度达到 3-4 x 106 个活细胞/mL，并让细胞过夜生长。

第0天：转染

  1. 根据 ExpiCHO 试剂盒方案，将细胞稀释至 6 x 106 个活细胞/mL。
  2. 向24深孔板 (24DWB) 的各孔中分装 2.5 mL 细胞，用于转染。

    • 建议向任何未使用的孔中加入等体积的 PBS，以尽量减少蒸发。

  3. 制备 ExpiFectamine 试剂-DNA 复合物。

    备注：以下示例用量将得到足以转染1个孔的复合反应体系。对于其他孔数的转染，可按比例缩放用量。

    • 对于对于待转染的各孔，通过取 2.0 µL 质粒 DNA（假设储备液浓度为 1 mg/mL）加入 220 µL OptiPRO SFM 中，稀释质粒 DNA，并使用移液器轻轻上下吹吸 3-4 次混匀。
    • 向稀释后的 DNA 中加入 9.0 µL ExpiFectamine CHO 试剂，并使用移液器轻轻上下吹吸 3-4 次混匀。

  4. 在 24DWB 中，向含有培养物的各孔中加入 200 µL 复合混合物。

    • 当加至步骤4所得的 2.5 mL 培养物中时，得到的质粒 DNA 终浓度约为 0.8 µg/mL。该步骤的最终质粒 DNA 浓度为 0.6-0.8 µg/mL，是大多数蛋白生产的典型浓度。

  5. 用透气密封膜盖住培养板。
  6. 将 24DWB 置于 37℃、含 8% CO2 的加湿培养箱中的定轨摇床上（对于定轨直径为 19 mm 的摇床，推荐振荡速度为 225 rpm）孵育。

第1天：添加增强剂和补料

  1. 转染后第 18-22 小时，加入 ExpiFectamine CHO 增强剂和 ExpiCHO 补料。

    备注：所有用量均可按比例缩放。

    标准方案：对于整个 24DWB，在锥形管中混合 400 µL ExpiFectamine CHO 增强剂和 16 mL ExpiCHO 补料。向 24DWB 的各孔中分别加入 600 µL 该混合物。将 24DWB 放回含 8% CO2 的 37℃ 培养箱中，振摇孵育。

    高滴度方案：对于整个 24DWB，在锥形管中混合 400 µL ExpiFectamine CHO 增强剂和 16 mL ExpiCHO 补料。向 24DWB 的各孔中分别加入 600 µL 该混合物。将 24DWB 转移至含 5% CO2 的 32℃ 培养箱中，振摇孵育。

第 7-10 天：收获上清液

  1. 由于蒸发，建议在转染后的以下天数收获上清液：

    标准方案：转染后第 7-8 天收获上清液。

    高滴度方案：转染后第 7-10 天收获上清液。

    使用两种方案获得的人 IgG 表达结果见图2。
标准和高滴度 24DWB 方案的产量图

图2.使用摇瓶或 24DWB 获得的人 IgG 表达结果比较。

在 50 mL 微型生物反应器中进行转染

材料

  • 带疏水性通气盖的 50 mL 微型生物反应器（Corning，货号 431720）
  • 摇床，带有可成 45° 角的试管架

    备注：本方案中 240 rpm 的振荡速度适用于定轨直径为 19 mm 的摇床。对于定轨直径更大的摇床，可能需要调低振荡速度。

    备注：本方案中的程序适用于 15-20 mL 的转染体积。其他体积将需要优化振荡速度，以确保最大性能。以下提供的示例假定转染体积为 15 mL（见步骤4）。对于 15 mL 以外的转染体积，应按比例缩放试剂用量。

常规传代培养

  1. 根据 ExpiCHO 试剂盒方案，传代培养并扩增 ExpiCHO-S 细胞，直至细胞密度达到约 4-6 x 106 个活细胞/mL。

第 -1 天：分流细胞

  1. 转染前一天（第 -1 天），根据 ExpiCHO 试剂盒方案，分流 ExpiCHO-S 细胞使最终密度达到 3-4 x 106 个活细胞/mL，并让细胞过夜生长。

第0天：转染

  1. 根据 ExpiCHO 试剂盒方案，将细胞稀释至 6 x 106 个活细胞/mL。
  2. 向各微型生物反应器中分装 15 mL 细胞，用于转染。
  3. 制备 ExpiFectamine 试剂-DNA 复合物。

    备注：以下示例用量将得到足以转染1个微型生物反应器的复合反应体系。对于其他数量的微型生物反应器转染，可按比例缩放用量。

    • 对于各待转染的微型生物反应器，通过取 12 µL 质粒 DNA（假设储备液浓度为 1 mg/mL）加入 1.2 mL OptiPRO SFM 中，稀释质粒 DNA。
    • 向稀释后的 DNA 中加入 50 µL ExpiFectamine CHO 试剂，并使用移液器轻轻上下吹吸 3-4 次混匀。
       
  4. 向含有 ExpiCHO-S 细胞（6 x 106 个活细胞/mL）的各微型生物反应器中加入 1.2 mL 复合混合物。

    • 当加至步骤4的 15 mL 培养物中时，得到的质粒 DNA 终浓度约为 0.8 µg/mL。该步骤的最终质粒 DNA 浓度为 0.6-0.8 µg/mL，是大多数蛋白生产的典型浓度。
       
  5. 将微型生物反应器置于 37℃、含 8% CO2 的加湿培养箱中的定轨摇床上（对于定轨直径为 19 mm 的摇床，推荐振荡速度为 240 rpm）孵育。微型生物反应器应固定在设定为 45° 角的 50 mL 试管架上。

第1天：添加增强剂和补料

  1. 转染后第 18-22 小时，加入 ExpiFectamine CHO 增强剂和 ExpiCHO 补料。

    标准方案： 对于每个微型生物反应器，在锥形管中混合 90 µL ExpiFectamine CHO 增强剂和 3.6 mL ExpiCHO 补料，并将该混合物全部加入微型生物反应器中。对于其他数量的微型生物反应器，可按比例缩放用量。将微型生物反应器放回含 8% CO2 的 37℃ 培养箱中，振摇孵育。

    高滴度方案： 对于每个微型生物反应器，在锥形管中混合 90 µL ExpiFectamine CHO 增强剂和 3.6 mL ExpiCHO 补料，并将该混合物全部加入微型生物反应器中。对于其他数量的微型生物反应器，可按比例缩放用量。将微型生物反应器转移至含 5% CO2 的 32℃ 培养箱中，振摇孵育。

第 7-10 天：收获上清液

  1.  建议在转染后的以下天数收获上清液：

    标准方案：转染后第 7-8 天收获上清液。

    高滴度方案：转染后第 7-10 天收获上清液。

    使用两种方案获得的人 IgG 表达结果见图3。
标准和高滴度微型生物反应器方案的产量图

图3.不同转染体积下使用摇瓶或微型生物反应器获得的人 IgG 表达结果比较。

仅供科研使用，不可用于诊断目的。