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概述

限制性内切酶克隆问题排查表
问题可能原因建议
很少或没有克隆转化效率差使用随产品提供的pUC19对照质粒验证您所用的大肠杆菌感受态细胞的转化效率。同时请参阅转化问题排查。
连接反应不成功确认载体或插入片段含有一个5’磷酸基团
通过连接lambda DNA/Hind III分子量标准并与未连接的分子量标准进行电泳比较来验证连接反应的组分。分子量标准的条带应该消失，同时会出现一个高分子量的拖尾条带。您也可以尝试连接限制性内切酶单切后的载体。
通过向 lambda DNA /Hind III分子量标准连接反应中加入一些插入片段和载体DNA来验证其中是否含有连接反应的抑制剂。如果仅有分子量标准的时候连接可以进行，而当存在另一种DNA时，连接不能进行，则另一种DNA中存在抑制剂。这样就需要在连接反应之前纯化你的DNA。
确保用于制备载体和插入片段的限制性内切酶已经通过酚抽提和缓冲液置换被去除，或者至少已经被灭活。
载体和/或插入片段的酶切不完全将酶切产物进行凝胶电泳来确认酶切状况。如果酶切不完全，则要进行重新酶切或凝胶纯化酶切完全的片段。
如果通过PCR引物引入限制性酶切位点，确保在限制性酶切位点的上游有足够的保护核苷酸以实现有效的酶切（保护碱基的数目取决于所使用的限制性内切酶，一般建议至少为6个碱基）。
确保使用了正确的缓冲液用于酶切。
不兼容的末端确保生成的末端是互相兼容的（平末端和平末端，或互相兼容的突出序列）。
抗生素使用浓度过高确保使用了正确量的抗生素。
使用了错误的抗生素确保使用载体上带有的抗性基因对应的抗生素。
DNA损伤或DNA有切口DNA在凝胶纯化过程中，尽可能减少暴露于紫外光的时间
很多克隆没有包含插入片段载体自连载体去磷酸化不彻底。通过对去磷酸化的载体连接和转化来验证。重复CIAP对载体的处理。
仍存在未被酶切的载体通过转化酶切后未进行连接的载体来验证。对酶切后的载体进行凝胶回收后再用于连接。
插入片段对细胞有毒性尝试在较低温度（30摄氏度或室温）培养细菌。克隆出现将需要更长时间。
尝试使用不同菌种（例如Stbl 2 大肠杆菌）
很多克隆不包含质粒使用的抗生素浓度过低确保使用正确浓度的抗生素。
抗生素发生降解进行一个假转化（无载体）以确认抗生素筛选是正常工作的。
我正在尝试克隆一个可能非常有毒的插入片段。我使用过DH5α和TOP10细胞进行转化但是没有在平板上得到克隆。你们能为我提供一些建议吗？

如果插入片段对于宿主细胞有潜在毒性，您可以尝试以下建议：

  • 转化TOP10或DH5α细胞后，在25-30摄氏度而不是在37摄氏度孵育。这会降低生长速度并能提高克隆具有潜在毒性的插入片段的几率。
  • 尝试使用TOP10F’细胞进行转化，但是不在培养板中加入IPTG。这些细胞带lacIq抑制子，会抑制从lac启动子起始表达，因此能克隆毒性基因。请注意，没有加入IPTG时不能进行蓝白筛选。
  • 尝试使用Stbl2细胞进行转化

消化

我想使用两种不同的酶进行双酶切但是缓冲液不兼容。我应该如何解决这一问题？

你可以进行分步酶切，即先用第一种酶消化，对反应产物进行纯化（例如，用琼脂糖凝胶或离心柱），然后使用第二种酶进行消化。此外，如果您需要从低盐缓冲液置换到高盐缓冲液，你可以先进行第一次消化，然后加入盐和第二种酶进行消化，从而跳过了纯化步骤。

我正在进行限制性酶切克隆，而我使用的酶似乎出现了非特异性切割。这是为什么？

一些限制性内切酶显示出“星号活性”，它们切割与它们的识别序列相似的序列。下列一些条件可能会引起星号活性（不同的酶受每种条件的影响不尽相同）。

  • 不正确的缓冲液条件：确保在单酶切或双酶切时使用推荐的缓冲液。
  • 孵育时间过长：使用完成酶切所需的最短时间。
  • 有机溶剂（乙二醇>45%，二甲亚砜（DMSO）>8%，乙醇>12%，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺（DMF），环丁砜）
  • 高浓度甘油（>5%）。Invitrogen™ 限制性内切酶（RE）以含有50% w/v甘油的形式提供，因此RE使用量不应超过酶切反应最终体积的10%。
  • 酶/DNA用量比过高（>25 U/μg）：使用所需的最低量的酶，这将避免将过多的甘油带入反应体系。
  • Mn++或其它二价离子替换了Mg++：确保使用推荐的缓冲液。
  • 高pH值（>8.5）：确保使用推荐的缓冲液。
我克隆了我的基因并转化进TOP10细胞中。然后我进行了质粒小抽并对质粒进行Xba I酶切。但是，载体没有被正确切开。你能帮我解决这一问题吗？

XbaI酶切位点是Dam甲基化敏感的酶切位点。dam(+)的E. Coli菌株，如TOP10，表达甲基化酶Dam。您可以尝试重新转化一种dam(-)菌株，例如INV110。下面列出了其它对dam (和dcm)敏感的限制性内切酶位点：

  • Dam敏感：Bcl I, Cla I, Hph I, Mbo I, Mbo II (Nde II), Taqα I, Xba I, BspH I, Nru I
  • Dcm敏感：Ava II, EcoO 109 I, EcoR II, Sau96 I, ScrF, Stu I, Aat I, Apa I, Ban I, Sfi I

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