激光捕获显微切割 (LCM) 支持—疑难解答

切割和包埋步骤对于 LCM 样本的 RNA 质量至关重要。我们建议使用整个相邻切片或切割大面积的切片（>1000 个细胞）来进行 RNA 分离。在进行 LCM 显微切割之前，我们建议评估从相邻切片中分离出的 RNA 的质量。有了大量 RNA，实验人员可以使用 Qubit™ RNA HS 检测试剂盒和 Agilent 生物分析仪来评估 RNA 的数量和质量。这将有助于确保从少量 LCM 细胞获得优质 RNA。 

福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 样本为基因表达谱分析和基因表达定量测定带来了独特的挑战，包括 RNA 分子的化学修饰和片段化。初始石蜡印迹的制备和储存对 RNA 质量有重大影响。由于 RNA 降解逐渐增加，存档 FFPE 样本会带来其他挑战。因此，并非所有 FFPE 样本都含有高质量 RNA。 

此外，生物分析仪从 FFPE 样本生成的典型 RNA 图谱看起来可能存在碎片化和降解的情况，因此，在确定 RNA 的可转录性时，该方法可能不实用。所以，我们建议进行组织刮片试验。您可使用整个相邻切片来分离 RNA，并评估完整 RNA 的 RNA 数量和质量。可使用来自 β-肌动蛋白基因 5’ 端和 3’ 端的两组设计用于扩增 β-肌动蛋白靶序列内的短 DNA 片段的 β-肌动蛋白基因特异性引物，采用实时荧光定量 PCR 技术估计给定样本中与 β-肌动蛋白含量相关的 RNA 量。来源于 3' 引物集的 RNA 量用于定量测定 FFPE 组织刮片中的 RNA。从两组 PCR 引物得到的 RNA 得率的比值即为 3'⁄5' 之比，该比值被用作 RNA 质量的指标。如果 5’ 端 β-肌动蛋白引物的产物得率较低，则表明 RNA 全长序列较少。

以下是可能的原因和解决方案：

• 样本可能残留有水分。确保乙醇溶液是新鲜的。乙醇具有吸湿性。请盖紧乙醇瓶盖，在立即使用前不要倒入乙醇溶液。如果您怀疑 100% 乙醇溶液吸有水分，请购买一瓶新的乙醇溶液。
• 在实验步骤之间，样本可能变干。稳步地执行实验方案中的“染色和脱水”步骤。

PixCell、Autopix 和 Veritas 仪器已停产，我们不再为其提供支持。不过我们提供以旧换新的选择，可用这些仪器换取 ArcturusXT™ 仪器。如有其他问题，请通过 techsupport@thermofisher.com 联系技术支持部门。