核酸凝胶电泳及印迹支持 - 问题排查

首先，检查你的琼脂糖凝胶的浓度。较高浓度的凝胶能帮助你分离较小分子量的分子，而较低百分比的凝胶能帮你分离较大分子量的分子。

检查电源，确定电流是否有通过凝胶。电泳缓冲液组成必须和凝胶的化学性质吻合。

通常，模糊的条带是由于使用了错误的缓冲溶液。检查电泳缓冲液和凝胶缓冲液的pH和盐浓度。模糊条带还有可能是因为样本中盐离子过多或者凝胶放置过久。

我们建议电泳更长时间或者使用一块对你的目标分子量范围有更高分辨率的凝胶。

对于单排胶孔凝胶，电泳时间不要超过60分钟，对于双排胶孔凝胶，电泳时间不要超过25分钟。电泳时间过长离子将被耗尽，凝胶将被损坏。对于E-Gel 48琼脂糖凝胶，电泳时间不要超过30分钟，对于E-Gel 96琼脂糖凝胶，电泳时间不要超过20分钟。

DNA质粒的构象会影响它在凝胶内的迁移。质粒DNA可以是超螺旋的（天然3D构象），有切口环状的（一条链上有切口），或者线性的（两条链都有切口）。你可能在琼脂糖凝胶上看到所有这三种形式。其中超螺旋DNA迁移最快，在凝胶中的位置最靠下；线性DNA条带在凝胶中位于中间位置，而带有切口的DNA通常出现在凝胶最顶部，因为它迁移最慢。

虽然我们建议将它们保存在室温，但这些凝胶仍然可以使用。在电泳前将这些凝胶平衡至室温以获得最佳效果。

可能的原因有：

• 上样了太多的DNA。我们建议每孔上样20–100 ng DNA；但是，你可以每孔上样最多500 ng。
• 使用了高盐浓度的样本。样本中离子浓度>50 mM NaCl, 100 mM KCl, 10 mM醋酸离子，或100 mM EDTA时，将降低分辨率。
• 样本可能使用了TAE稀释，而不是使用了TE或者水。
• 电泳时间过长。我们建议电泳25-30分钟以获得平直的条带。不要电泳超过60分钟，否则凝胶将被损坏。
• 使用了过高电压或过强电流。如果使用带电源的E-Gel基座，电泳时应使用60–70 V (恒定电压) or 40–50 mA (恒定电流)。电流不能超过60 mA。
• 在E-Base™仪器上电泳E-Gel 96琼脂糖凝胶时，确保您使用的是“EG”程序而非“EP”程序，“EP”程序是用于E-PAGE™凝胶的。
• 样本上样不正确或样本上样量太低。
• 凝胶没有在上样后立即电泳（为获得最好结果，请在上样后15分钟内开始电泳）。

请确保您没有过量上样并且在移除梳子时胶孔没有被损坏。

请检查 E-Gel胶盒和铜电极。你可以换一个新的胶盒看看是否接触不良。过冷的胶盒或不恰当的操作条件也可能造成这个问题。胶盒应在室温使用，避免将其保存在4°C。

这里是一些建议：

• 用酒精和Kimwipes纸巾擦拭胶盒。
• 对相机镜头进行清洁。
• 对成像系统的曝光时间和亮度选项进行调整。

请检查iBase™电源系统的电源线。PowerBase™ v.4系统和E-Gel Safe Imager™实时透射仪的电源线经常被混淆。如果用错电源线，虽然风扇和LED灯将正常工作，但蓝光灯将不会工作。你需要使用iBase™电源线，它上面写有“48V”。

这里是胶跑得不正常的一些常见原因：

• 底座的铜电极因为不当使用而损坏。请确保底座的铜电极是完好的。
• 您使用的胶盒已经过期或有瑕疵。
• E-Gel EX胶盒没有正确的插入底座。
• 您使用了错误的适配器。

这里是一些可能的原因以及解决问题的建议：

• 过量上样。请不要上样超过建议的量。
• 高盐浓度。请稀释样本。
• 对E-Gel EX琼脂糖凝胶进行了预电泳，这类凝胶是不建议进行预电泳的。
• 上样体积过小或者上样方法不正确。
• 上样时可能引入了气泡。气泡会导致条带弯曲。请根据凝胶种类和上样方法加入推荐体积的样本。为获得合适的条带分离效果，我们建议保持上样量一致。向所有空孔内加入去离子水或TE，并且避免引入气泡。
• 没有在上样后立即进行电泳。请在上样后一分钟内开始电泳。
• E-Gel琼脂糖凝胶可能过期了。请检查产品效期。
• 电泳时间过长或电流过高。较长的电泳时间会引起电流的上升，导致条带迁移较差或者凝胶融化。对于每种凝胶类型，电泳不要超过建议的时间。

我们目前不提供和Mac电脑兼容的软件。请在装有 Windows XP Professional或Windows 7 Professional操作系统的32-bit或64-bit PC上运行该软件。

这一错误出现是因为有其它软件在后台运行，例如Internet Explorer浏览器，或者有杀毒软件正在运行从而限制了对一些文件的访问。
要解决这一问题，可以试试：

• 在安装过程中关闭Internet Explorer浏览器或任何其它程序。
• 关闭杀毒程序（或暂时卸载它），安装E-Gel 成像仪软件，然后重新打开或安装杀毒软件。
• 当错误出现时，选择“Ignore”以允许安装继续进行而不是“Retry（重试）”或“Abort（放弃）”。

按下激活按钮超过2秒之后，成像仪投射发光的时间将变成5分钟而不是30秒。

1) 检查相机罩或激活键处于正确位置以确保基座是激活的。
2) 光基座可能“超时”，但是电源指示灯仍然是亮的。关闭基座，然后重新打开。

如果出现了轻微的浑浊，可以在110°C高压灭菌5分钟溶解沉淀。不要在原装的容器内灭菌。这样做不会对TBE的缓冲性质产生不良影响。

这里有一些对您实验的建议：

• RNA样本可能被RNA酶降解了。遵循标准注意事项以避免污染。
• 确保在上样前对样本在70°C加热3分钟。如果没有这样做，则寡核苷酸不会被完全变性，导致出现拖尾。
• 确保在上样前彻底将尿素冲洗出上样孔。尿素会持续从凝胶渗入上样孔内。尿素很浓而且会使样本形成球状。
• 上样体积超过10 µL可能引起拖尾。这一体积比琼脂糖凝胶所用的上样体积小。
• 如果没有使用超纯水（18毫欧姆），则可能出现拖尾条带和高背景。
• 检查电泳缓冲液和上样缓冲液是否正确制备和稀释。
• 确保使溴酚蓝染料迁移到达边缘。过早停止电泳可能导致电泳效果较差。

你可以使用Reverse E-Gel 程序反向电泳使条带跑回到收集孔内。

请参考以下10种最能提高您的Northern杂交灵敏度的方法：

1) 提高每条泳道RNA的上样量（最多30 mg）。2）使用poly(A) RNA代替总RNA；10 mg poly(A) RNA相当于大约300-350 mg总RNA（3–5%）。3）换用ULTRAhyb Ultrasensitive杂交缓冲液。4）使用RNA探针而非DNA探针。5）使用下行碱性毛细管转膜法。6）使用最优的杂交温度。7）使用新鲜合成的探针。8）使用高特异性的探针（10^8至10^9 cpm/mg）。9）提高曝光时间（使用放射性探针检测低丰度信号时，曝光可能需要3天左右的时间）。10）根据制造商建议的方法将RNA交联到膜上。

点击此处查看更多相关的建议。

对于针对DNA或RNA目标的RNA探针：将膜放在含有0.1% SDS溶液的瓶内高压灭菌15分钟。如有必要可重复一次。对于仅针对DNA的DNA探针：您可以使用上述用于RNA探针去杂交的实验方案。另一个选择是进行碱变性。将膜在400 mM NaOH内孵育30分钟，然后用 0.1% SDS洗涤15分钟。这些剥离方法可以重复进行2-3次。但是，核酸会逐渐从膜上脱离。

rRNA占总RNA的大约80%。当10 µg总RNA被加入Northern凝胶泳道时， 18S和28S rRNA 条带各包含大约2–6 µg RNA。这些rRNA会和探针非特异性结合，也会和互补序列结合。探针与rRNA的非特异性结合可以通过使用最低量的探针以及仅标记与mRNA互补的序列而减少。使用碱性缓冲液进行转膜可以避免探针非特异性结合。最后，您可以使用较高的杂交和洗涤温度以使探针和rRNA的交叉杂交最小化。

残留RNA可能是由于：

• 转膜缓冲液体积不足（>0.5 mL/cm2）
• RNA量过多。
• 所用的凝胶太厚（>6 mm）。
• 转膜时间不足（我们建议20分钟/毫米）

弱信号可能是由于下列原因引起的：

• 杂交温度不合适。
• 探针降解（放置时间过久）
• 探针特异性低（随机引物法应得到大约2 x 10^9 cpm/ug的探针）
• 探针未变性（针对DNA探针而言）
• 探针浓度太低（<10^6 cpm/mL）
• 需要更长的杂交时间。
• RNA转膜效果不好。
• 紫外交联不足或过度曝光。
• 碱性转膜时间过长（>4 小时）。
• 使用了错误的膜（硝酸纤维素）。
• 没有按照非同位素检测实验方案。
• 信使RNA和核糖体RNA共迁移。
• 增强屏使用不正确。

背景信号有多种类型，而每种类型的产生原因也不同：

1) 遍布印迹膜的斑点状信号：这有可能是因为膜的质量不好，过分干燥或者操作者使用不当（例如，沾到了皮肤上的油脂、手套上的粉末）。请使用新的高质量尼龙膜，操作时使用镊子夹取膜的边缘。斑点状信号还可能是因为杂交试剂的不均匀分布。不要将探针直接加入到浸入杂交溶液的膜上；应先使用杂交溶液稀释探针。

2) 整条泳道出现拖尾：针对特定探针的杂交条件大大低于最优条件将导致泳道特异性的背景和/或严重的交叉杂交。可以在开始时使用较高的杂交温度然后缓慢降温直至得到特异性信号。高探针浓度，尤其是对于非同位素探针，也可能导致泳道特异性背景。请使用10 pM 非同位素标记的DNA探针或者0.1 nM非同位素标记的RNA探针。

3) 遍布印迹膜的斑块：制备探针时掺入不足（或者未掺入的核苷酸没有被移除）会引起膜上的斑块。检查探针质量并移除未掺入的核苷酸。探针制备过程中或杂交缓冲液中的颗粒物（例如当没有完全溶解时）也会造成膜上的斑块。确保这些试剂完全溶解，并且可以考虑使用微型离心机或低速离心机离心，或者使用0.22 µm滤膜过滤以除去颗粒物。

如果你看到和泳道不相关的背景信号，这可能是由于：

• 质量差的膜或者不兼容的膜。
• 膜在操作过程中过于干燥。
• 试剂没有均匀分布。
• 微生物污染。
• 膜上沉积了颗粒物。
• 非同位素检测试剂中有颗粒物。
• 膜上有干掉的琼脂糖或转膜缓冲液。
• 胶片曝光过程中产生了静电。
• 膜在和胶片接触时太湿。

下列原因会造成交叉杂交：

• 探针浓度过高。
• 杂交/洗涤条件不够严格。
• mRNA中有多个探针靶点。
• 探针中的非同源序列过多。
• 与核糖体条带发生交叉杂交。当总RNA中有大量rRNA时会非特异性结合探针而导致这种情况。在这种情况下，您应该可以观察到特异性条带，但是它可能会很弱。
• 杂交温度过低（可以试试提高温度至52°C）。