cDNA文库和cDNA文库构建 – 问题排查

RNA起始量较少可导致cDNA得率低。对于标准文库构建请使用0.5–5 µg起始mRNA，检验mRNA完整性，并使用RNA对照进行反应。尝试使用放射性标记实验方案评估cDNA合成反应的效率。我们也建议对转化效率和Gateway酶效率进行检测。

如果没有正确准备用于不同大小片段分离的柱子，也会导致cDNA得率低。在加入更多缓冲液前，应使柱子完全干燥，并应确保流速/液滴大小合适。

较小的平均插入片段大小可能是因为attB1接头污染、mRNA样品部分降解、片段分离存在问题和/或起始mRNA量不足。

检查一下BP重组中使用的cDNA量是否不足，因为这可能使得重组子比例较低。

当克隆含有较小的插入片段时，更有可能在相似的attL1和attL2位点之间形成一个发夹结构，从而容易发生上述情况。为了解决这一问题，请遵循以下建议：

• 使用可制备高质量质粒DNA的试剂盒，如PureLink HiPure Plasmid Miniprep试剂盒。
• 每个测序反应使用约700 ng的DNA。
• 应确保克隆经BsrG I限制性内切酶酶切鉴定具有有效插入片段。如果克隆中没有插入片段，则限制性酶切分析只会显示2.4 kb的载体主条带。在这种情况下，空克隆的测序结果通常很差。
• 尝试使用一套新的测序引物。
• 可根据下述参考文献的描述，使用封闭oligo：Esposito D, Gillette WK, Hartley JL. (2003) Blocking oligonucleotides improve sequencing through inverted repeats.Biotechniques 35:914-920.
• 对于特别难测序的克隆，您可通过LR转移反应将克隆转入选定的目标载体中。attB位点比attL位点小很多，因此更容易测通。