蛋白质分子量标准品支持 — 问题排查

建议如下：

• 检查使用的凝胶类型/凝胶百分比。可能会由于凝胶类型和/或百分比的不同而不能看到所有条带。例如，蛋白质标准品的最小条带可能不能在非常低百分比的凝胶上分辨，而较高分子量条带可能不能在高百分比凝胶上分辨。
• 检查蛋白质分子量标准品的有效日期。由于蛋白质降解，过期批次可能导致条带褪色或缺失。
• 检查蛋白质分子量标准品的储存条件。不适当的储存条件会损害标准品中蛋白质的稳定性。
• 确保蛋白质分子量标准品在上样到凝胶上之前未加热/煮沸。我们的蛋白质分子量标准品可直接上样，我们不建议将其加热/煮沸，因为这可能会导致标准品中的蛋白质降解。

建议如下：

• 确保每个泳道上标准品的量都是正确的。蛋白质上样过多会导致模糊，这个问题在使用银染凝胶时尤为突出。
• 条带在低百分比凝胶中不能很好地分辨。尝试使用更高百分比的凝胶。
• 如果在转膜/检测后条带看起来不明显和模糊，可能是由于抗体浓度过高。遵循制造商建议的稀释度或通过斑点印迹确定最适抗体浓度。

• 上样时，请注意确保相邻样品泳道没有交叉污染。
• 确保每个泳道上标准品的量都是正确的。蛋白质上样过多会导致产生额外的条带，这个问题在使用银染凝胶时尤为突出。
• 标准品储存不当或反复冻融会导致蛋白质降解。

预染标准品具有与每种蛋白质共价结合的染料，这将导致标准品在不同的缓冲系统（即不同的凝胶）中迁移率不同。因此，使用预染标准品进行分子量估算将仅得出蛋白质的表观分子量。预染标准品可用于分子量估算、确认凝胶迁移和估算转膜效率，但对于需要精确估算分子量的应用，应使用非预染标准品。

• 增加电压、电流或转印时间
• 凝胶和SDS-蛋白质复合物中的SDS会促进蛋白质从凝胶中洗脱，但抑制蛋白质与膜的结合。这种抑制作用在硝化纤维素膜上的强度大于PVDF膜。对于难以从凝胶中洗脱的蛋白质，如大分子量蛋白质，可在转膜缓冲液中加入少量SDS以改善转印效果。我们建议在组装三明治前将凝胶置于含0.02–0.04% SDS的2x转膜缓冲液（无甲醇）中预平衡10分钟，然后使用含10%甲醇和0.01% SDS的1X转膜缓冲液进行转印。
• 甲醇可去除SDS-蛋白质复合物中的SDS，促进蛋白质与膜的结合，但对凝胶本身有一些不良影响，会降低转印效率。甲醇可能导致孔径减小、某些蛋白质发生沉淀以及一些碱性蛋白质带正电荷或变为中性。应确保转膜缓冲液的甲醇浓度不高于10–20%，并使用高质量的分析级甲醇。

• 降低电压、电流或缩短转印时间
• 确保转膜缓冲液的甲醇浓度合适；可使用浓度为10–20%的甲醇，从而去除SDS-蛋白质复合物中的SDS，并促进蛋白质与膜的结合。
• 确保转膜缓冲液的SDS浓度合适（若加入了SDS），SDS浓度不要超过0.02–0.04%。过多的SDS会阻碍蛋白质与膜的结合。过多的SDS会阻碍蛋白质与膜的结合。
• 检查膜的孔径和靶标蛋白质的大小。小于10kDa的蛋白质很容易穿过0.45μm孔径的膜。如果您的目标蛋白质小于10 kDa，那么最好使用0.2μm孔径的膜。

褪色最可能是由于封闭/洗涤液中的洗涤剂将一些蛋白质从膜上洗脱造成的。染料本身不会从蛋白质上洗脱，因为它们是共价结合的。我们已经发现较小孔径的膜可以在封闭和洗涤过程中更好地保留蛋白质，因此，为了获得绝佳的分辨率和蛋白质保留率，推荐使用0.2 µm代替0.45 µm的膜。转印后，可以用铅笔在膜上圈出预染条带，从而在封闭和处理后仍可辨认条带位置。

建议如下：

• 验证检测试剂是否有效。优化抗体浓度以获得绝佳结果。
• 确保凝胶上标准品的量都是正确的。
• 优化转印条件（电流、电压、转印时间）。
• 酶偶联的一抗可能不能与MagicMark XP免疫印迹蛋白质分子量标准品中的蛋白质有效结合。我们建议使用未偶联的一抗，然后加入酶偶联的二抗。
• 注意：抗myc-AP / HRP和抗V5-AP / HRP抗体不会与MagicMark XP蛋白结合。

以下是一些可能的原因和解决方案：

以下是一些可能的原因和解决方案：

以下是一些可能的原因和解决方案：

以下是一些可能的原因和解决方案：

以下是一些可能的原因和解决方案：

以下是一些可能的原因和解决方案：

以下是一些可能的原因和解决方案：

以下是一些可能的原因和解决方案：

以下是一些可能的原因和解决方案：

以下是一些可能的原因和解决方案：

以下是一些可能的原因和解决方案：

这可能是由于染料前缘没有跑下凝胶或从印迹中去除。我们建议使染料前缘跑下凝胶或将其从印迹中去除。

以下是一些可能的原因和解决方案：

Primary antibodies with low starting concentrations may result in insufficient chemiluminescent detection of the western blot positive control bands. If the unstained 30 kDa and 80 kDa bands produce weak or no signal, spike the diluted primary antibody with the corresponding rabbit IgG or mouse IgG to a concentration of 1-5 µg/mL, prior to secondary antibody incubation. Follow with respective secondary (GAM/GAR) incubation to increase the intensity of western blot positive control bands in the iBright Prestained Protein Ladder.